HPLC-基础知识
高效液相色谱知识收藏
高效液相色谱知识收藏1. 分离原理：HPLC利用固定在填料中的固定相和流动相（溶剂）之间的相互作用来分离混合物中的化合物。
固定相通常是多孔填料，而流动相则是溶解样品混合物的溶剂。
在流动相的作用下，样品中的化合物会以不同速率通过固定相，从而实现分离。
2. 设备组成：HPLC主要由溶剂输送系统、样品进样器、固定相柱和检测器组成。
溶剂输送系统用于向柱中输送流动相，样品进样器用于将样品注入HPLC系统，固定相柱用于实现化合物的分离，检测器用于检测分离出的化合物。
3. 应用领域：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全、生命科学研究等领域。
它可以用于分离和测定各种化合物，包括药物、天然产物、食品添加剂等。
4. 操作要点：在进行HPLC分析时，需要注意溶剂的选择、固定相柱的条件、检测器的调试等细节。
同时，样品的预处理和进样器的设定也会影响分析结果的准确性和稳定性。
5. 数据分析：HPLC分析通常会生成大量的数据，包括色谱图谱、保留时间、峰面积等。
对这些数据进行分析和解释是HPLC分析的关键步骤，可以借助数据处理软件进行数据分析和处理。
总的来说，HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
在HPLC分析中，固定相柱是至关重要的部分，不同的固定相柱适用于不同的样品类型和分离要求。
以下是一些常见的固定相类型：1. 反相色谱柱：反相色谱利用极性差异来进行化合物的分离，通常用于水溶性化合物的分离。
反相色谱柱的填料通常是非极性的，比如碳链分子。
常见的反相色谱柱填料包括C18、C8、C4等，它们的碳链长度不同，可以实现对不同极性化合物的分离。
2. 正相色谱柱：正相色谱是基于化合物在极性填料上的分离，适用于非极性化合物的分离。
HPLC-基础知识
烃类族组成、石油中微量成分
无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、 化妆品、染料
液晶材料、合成高分子材料
无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、 甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳 烃
氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然 高分子化合物
目录
❖ 色谱分析法简介 ❖ 色谱法的分类 ❖ HPLC的特点及应用领域 ❖ HPLC的分类 ❖ HPLC相关的基本术语 ❖ HPLC的相关理论
❖ HPLC的定性分析 ❖ HPLC的定量分析 ❖ HPLC仪器的组成
输液泵 检测器 色谱柱 进样器 工作站
❖ P230的基本操作 ❖ HPLC方法的建立 ❖ 液相色谱常见问题及其对策 ❖ 液相色谱容易出问题的部件 ❖ 仪器的维修和保养
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N C18 十八烷基硅烷键合硅胶
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击
_HPLC基础高效液相基本原理和使用方法
_HPLC基础高效液相基本原理和使用方法HPLC（高效液相色谱）是一种分离和分析化学品的常用技术。
它通过将需要分离的化合物溶解在流动相中，然后在高压马达的驱动下，将混合物通过填充了固定相的柱子，利用固定相与流动相间的相互作用来分离混合物中的成分。
HPLC主要由柱子系统、流动相系统、检测系统和数据处理系统组成。
HPLC的基本原理是通过不同样品成分与固定相之间的相互作用来分离化合物。
固定相可以是各种各样的填料，如硅胶、C18烷基硅胶等。
当样品进入柱子时，各个成分会以不同的速度进行吸附和解吸，从而分离出各组分。
流动相系统是HPLC中的重要部分，它主要负责将混合物带入柱子和在柱子中移动。
流动相可以是无机溶液，也可以是有机溶剂与无机溶液的混合物。
常见的流动相包括水，甲醇，乙酸和醋酸等溶液。
检测系统用于检测流出柱子的化合物并生成信号。
HPLC的常见检测器包括紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）和荧光检测器。
它们通过测量样品在不同波长下的吸收或荧光发射来定量分析各个组分。
数据处理系统用于接收和处理从检测系统获得的信号。
它可以通过线性回归方法将信号转换成样品浓度，并通过柱子排列和峰面积积分来确定样品中各成分的含量。
在使用HPLC之前，首先要准备样品。
样品的制备涉及样品的提取、纯化和浓缩等步骤。
样品提取方法的选择取决于所分析样品的性质和所需分离的化合物类型。
接下来，需要准备流动相。
选择适当的流动相是成功分析的关键。
流动相的选择根据所需分离的化合物种类，以及固定相和样品的亲疏水性来确定。
然后，选择适当的柱子。
柱子的选择取决于分析目标和分离条件。
HPLC柱子的尺寸和填料类型会影响分析的时间和分离的效果。
之后，需要设置检测器，并根据所需分析的化合物选择合适的检测器。
对于紫外-可见光谱检测器，需要选择合适的波长以提高灵敏度和分辨率。
在实际操作中，还需要考虑一些其他因素。
例如，设置压力和流速以控制样品在柱子中的流动速度。
还需要进行一些温度调节，以确保溶剂和柱子的稳定性。
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第一章高效液相色谱仪的特点混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素，色谱法是一种分离技术。
混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。
一相固定不动，称为固定相。
另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。
特点：高压、高效、高速、高灵敏适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
与GC 互补性三、液相色谱组成：（一）、输液系统泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪）（二）、附件过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。
（三）、工作程序：液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器（四）、泵体组成部分：电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴（五）、检测器组成部分：1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴）2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板）（六）、HPLC的分类1、吸附色谱Adsorption Chromatography用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。
依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
又分：a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱5、亲和色谱以在不同基体上，键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等）与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
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高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
hplc（液相色谱）常识及疑难详解（附实际操作图解lc-20a）
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
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HPLC基礎知識三、色譜法分類按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。
氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。
GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。
液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。
LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。
此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散係數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。
（此外還有電泳。
）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1〃液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。
分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。
常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。
適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。
常用於分離同分異構體。
2〃液液色譜法使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。
分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必頇預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化。
由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。
現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧一、引言高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。
色谱柱是HPLC系统的核心组成部分，其性能直接影响分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍HPLC色谱柱的基本原理、分类、使用及维护等方面的专业知识。
二、色谱柱的基本原理色谱法是一种基于不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡进行分离的物理化学方法。
HPLC色谱柱的核心是固定相，它是由硅胶、氧化铝、活性炭等颗粒状物质组成。
当样品溶液通过色谱柱时，不同物质根据其与固定相的相互作用力大小，依次从固定相中解吸下来，从而实现各成分的分离。
三、色谱柱的分类1.正相色谱柱：适合分离极性化合物，如糖类、醇类等。
2.反相色谱柱：适合分离非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。
3.离子交换色谱柱：适合分离带电离子或极性化合物，如氨基酸、核酸等。
4.体积排阻色谱柱：适合分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。
四、色谱柱的选择与使用1.根据分析物的性质选择合适的色谱柱。
2.确保色谱柱不受污染，使用前需进行清洗和活化。
3.避免过度使用压力，以延长色谱柱的使用寿命。
4.定期更换色谱柱，以保证分析结果的稳定性。
五、色谱柱的维护与保养1.使用后及时清洗色谱柱，防止残留物对柱子的污染。
2.色谱柱应储存于干燥、避光的环境中，避免受潮或暴晒。
3.对于长期不用的色谱柱，应定期检查其性能并进行活化处理。
4.避免将色谱柱置于高温或低温环境中，以防止硅胶固定相产生裂纹或变形。
5.定期更换流动相，以保证流动相的质量和稳定性。
同时，流动相的pH值应控制在固定相所能承受的范围内。
6.在使用过程中，应时刻关注色谱柱的压力变化。
若发现异常压力或突然变化，应及时检查柱子是否堵塞或受损。
若确有问题，应立即停止使用并进行修复或更换。
7.在使用过程中，还应注意观察色谱峰的形状和大小。
若发现异常峰或分离效果变差，应考虑更换流动相或清洗柱子。
若问题仍未解决，应考虑更换色谱柱。
HPLC知识收藏
高效液相色谱知识收藏1.Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤 (2)2.Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： (4)3.高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法 (6)4.液相色谱柱使用及保养 (7)5.高压液相色谱HPLC培训教程(一) (8)6.高压液相色谱HPLC培训教程(二) (9)7.高压液相色谱HPLC培训教程(三) (11)8.高压液相色谱HPLC培训教程(四) (13)9.高压液相色谱HPLC培训教程(五) (16)10.高压液相色谱HPLC培训教程(六) (18)11.高压液相色谱HPLC培训教程(七) (21)12.高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生 (22)13.HPLC对流动相的基本要求 (25)14.高效液相色谱 (26)15.Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程 (37)16.高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项 (40)17.色谱扫盲班 (41)Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤(一)、开机：1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
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B A
这种方法能使样品的各组分获得良好 的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂 后，可获得纯度较高的物质。目前，这种 方法是色谱法中最常用的一种方法
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性 流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力 比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直 接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将 各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依 次顶替出固定相 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先 流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲 线如下图
液相色谱的流动相
mobile phases of LC
1. 流动相特性
（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况
（2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性 柱也称正相柱
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型 分离柱上的出峰顺序相反
耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定 （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性 （4）有利于梯度洗脱
存在着双重分离机制 (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主 低覆盖率：吸附为主
2.液-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等 结构类型：全多孔型和薄壳型 粒度：5～10 μm
亲和色谱(AC)
Affinity chromatograph
原理：利用生物大分子和固 定相表面存在的某种特异性 亲和力，进行选择性分离
先在载体表面键合上一种具 有一般反应性能的间隔臂 (环氧、联胺等)，再连接上 配基(酶、抗原等)，这种固 载化的配基将只能和具有亲 和力特性吸附的生物大分子 作用而被保留。改变淋洗液 后洗脱
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分 与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形 式等有关。亲和力大，保留时间长 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH-
由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体，早期采用
100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见
现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料 （2）表面多孔型担体
（薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表 面附着一层厚度为1 ～ 2μm 的多孔硅胶 表面积小，柱容量底
（3）化学键合固定相
土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有 机成分
烃类族组成、石油中微量成分
无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、 化妆品、染料
液晶材料、合成高分子材料
无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、 甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳 烃
氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然 高分子化合物
利用组分在固定液（固定相）中溶解度 不同而达到分离的方法称为分配色谱法
利用组分在离子交换剂（固定相）上的 亲和力大小不同而达到分离的方法，称 为离子交换色谱法
利用大小不同的分子在多孔固定相中的选 择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱 法或尺寸排阻色谱法
最近，又有一种新分离技术，利用不同组 分与固定相（固定化分子）的高专属性亲 和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常 用于蛋白质的分离
人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物 化学成分
HPLC的分类
高效液相色谱法按照分离机制可以分为以下几类 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 离子色谱 离子对色谱 排阻色谱 亲和色谱（AC）
液-固吸附色谱
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝 等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂
反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相， 试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配
排阻色谱色谱
size- exclusion chromatography
固定相：凝胶(具有一定大小孔 隙分布)
原理：按分子大小分离。小分 子可以扩散到凝胶空隙，由其 中通过，出峰最慢；中等分子 只能通过部分凝胶空隙，中速 通过；而大分子被排斥在外， 出峰最快；溶剂分子小，故在 最后出峰
3. 按固定相的外型分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱
固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱， 它又可分为薄层色谱和纸色谱
4. 按照展开程序分类
按照展开程序的不同，可将色谱法分为 洗脱法、顶替法、和迎头法 洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品 加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力 比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。 由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力 不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同， 从而使组分彼此分离。流出曲线下图
应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等
离子色谱
ion chromatography
离子色谱是在20世纪70 年代中期发展起来的一 种技术，其与离子交换 色谱的区别是其采用了 特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作 为柱填料，并采用淋洗 液抑制技术和电导检测 器，是测定混合阴离子 的有效方法
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配
对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动 相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反பைடு நூலகம்，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺 序相反
离子交换色谱
ion-exchange chromatography
柱色谱 平板色谱
纸色谱 薄层色谱
按分离效率分
经典液相色谱 高效液相色谱
HPLC的特点
优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好， 定量精度高，应用范围广
缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分 子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多
分离原理图解
适用于分析高沸点、大 分子、强极性、热稳定 性差的化合物
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布
HPLC应用领域
HPLC是目前应用最广泛的分离方法。已 广泛地用于石油化工、有机合成、生理生 化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生 产在线控制，乃至空间探索等许多领域
应用领域 环境 农业 石油 化工 材料 食品
生物 医药
分析对象举例
常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害 重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分
AB
此法适于制备纯物质或浓缩分离某 一组分；其缺点是经一次使用后，柱子 就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子 或除去被柱子吸附的物质后，才能再使 用
迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或 溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出， 其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二 组分混合物，以此类推。流出曲线如下图
离子对色谱
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的 离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶 质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够 在两相之间进行分配
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基 铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠 作为对离子
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N C18 十八烷基硅烷键合硅胶
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇
、乙腈、甲醇 、水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间
HPLC相关的基本术语
固定相 流动相 色谱流出曲线和色谱峰 基线和峰高 保留值 区域宽度 分离度 溶剂等级
液相色谱固定相
stationary phases of LC
定义：在HPLC分离过程中，在柱内静止不动的一 相，即柱内填料
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体
P230的基本操作 HPLC方法的建立 液相色谱常见问题及其对策 液相色谱容易出问题的部件 仪器的维修和保养
色谱分析法简介
色谱法是一种重要的分离分析方法 ，它利 用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分 配系数的微小差异进行分离。当两相作相 对移动时，使被测物质在两相之间进行反 复多次分配，使原来微小的差异累加产生 了很大的效果，形成差速迁移，使各组分 在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、 分析及测定一些物理化学常数的目的
“色谱”的来由
俄国植物学家 茨维特（Tswett） 1906年，他将从植物色素提取的石油醚提 取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端， 然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到 分离，在管内显示出不同的色带，色谱一 词也由此得名