C2C12细胞的生长特性
右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响
网络出版时间：2020 -8 -21 15 ：08 网络出版地址：htt p s ://kns . enki. netkems/detil/34. 1065. R. 20200820. 1449. 011. html右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响陈燕燕心，徐 魏'，向 力'，岳 静'，李兴元'，王 露'，郑 飞'，唐俊明3>4，郑 敏*22020 -05 -06 接收基金项目：国家自然科学基金（编号：81670272）；湖北省科技厅重大创新专项（编号：2018ACA162）;湖北医药学院创新团队 项目（编号:FDFR201601）;湖北医药学院生物医药研究院PI 项目（编号:HBMUPL01807）作者单位:1 4锦州医科大学湖北医药学院研究生培养基地，锦州1210012十堰市人民医院麻醉科（湖北医药学院附属人民医院），十堰4420003湖北医药学院附属十堰市人民医院临床医学研究所，十4420004湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰442000作者简介:陈燕燕，女，硕士研究生；唐俊明，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail:Wn/jm416@ 163 - dm ；郑 敏，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail ：lhj1286@163 .com摘要 目的 观察右美托咪定对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响，探究心力衰竭患者骨骼肌病的发病机制。
方法 用免疫组化分析C2C12细胞肾上腺素能受体的表达特征。
将C2C12细胞分为6组:对照组和右美托咪定5个浓度梯度组（5、10、20、40、80 mmol/L ）。
CCK-8法检测右美托咪定对C2C12细胞增殖的影响。
用分化培养基诱导C2C12 分化，按单次和连续单次的给药方式给C2C12细胞加药，分化6 d 后，用免疫荧光检测不同分组肌球蛋白重链（MYH ）、 肌细胞增强因子2C （ MEF2C ）、肌细胞生成蛋白# MyoG ）的表 达水平，并定量分析C2C12细胞分化、融合为含不同细胞核数的肌管数。
lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩及铁死亡相关蛋白的影响演示稿
地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩模型
地塞米松能够抑制小鼠C2C12细胞的增殖，导致细胞数量减少。
抑制细胞增殖
诱导细胞凋亡
改变细胞形态
地塞米松可以诱导C2C12细胞发生凋亡，导致细胞死亡。
地塞米松处理后的C2C12细胞形态变小，呈现出肌萎缩的特征。
03
02
01
肌萎缩时，肌肉组织中的蛋白质合成减少，导致肌肉质量下降。
lncRNA GPRC5D-AS1对铁死亡相关蛋白的影响：研究进一步发现，lncRNA GPRC5D-AS1能够调控铁死亡相关蛋白的表达。在地塞米松诱导的肌萎缩过程中，lncRNA GPRC5D-AS1可能通过调节铁死亡相关蛋白的表达，影响细胞的生存状态。
lncRNA GPRC5D-AS1的作用机制：研究揭示了lncRNA GPRC5D-AS1可能通过与某些关键基因的相互作用，影响其表达，进而影响肌萎缩和铁死亡相关蛋白的表达。这为理解肌萎缩和铁死亡的分子机制提供了新的视角。
详细描述
VS
lncRNAGPRC5D-AS1可能通过改变细胞形态，影响地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞肌萎缩过程。
详细描述
在肌萎缩过程中，lncRNAGPRC5D-AS1可能通过调控细胞骨架蛋白、细胞膜蛋白等，改变细胞形态，使其呈现肌萎缩的特征性变化，如细胞体积减小、细胞核变小等。
总结词
05
lncRNAGPRC5D-AS1对地塞米松诱导的小鼠C2C12细胞铁死亡相关蛋白的影响
铁死亡相关蛋白是一类在细胞铁死亡过程中发挥重要作用的蛋白质，它们参与了细胞内氧化应激反应、脂质代谢和细胞凋亡等过程。
这些蛋白通过调节细胞内铁离子的平衡、活性氧簇的产生以及脂质过氧化的程度等，影响细胞的生存和死亡。
C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验
复杂， 许多因素都可能起影响， 研究设计要尽量标准化。
关键词： 成肌细胞； 肌细胞； 肌管； 定向分化； 基因表达
中 图 分 类 号 ： Ｑ８１
文献标识码： Ａ
文章编号： １６７２－ ３５５４（ ２００８） ０１－ ００１０－ ０６
Ｉｎ Ｖｉｔｒ ｏ Ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ Ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｏｔｕｂｅｓ
渐 增 强 （ 未 刺 激 时 分 别 约 为４９．６％ ±１．１％、２３．４％ ±１．１％、４．８％ ±１．６％和 ２．６％ ±１．５％； 第 ６ 天 时 分 别 提 高 为
８０．４％ ±１．８％、８５．４％ ±１．１％ 、２２．２％ ±１．１％ 和 ２６．０％ ±１．６％ ； Ｐ ＜ ０．００１） ； ｄｅｓｍｉｎ、ＭｙｏＤ 和 ｍｙｏｇｅｎｉｎ 相 应 的
ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ－ｌｅ１， ＺＨＯＵ Ｇｕａｎｇ－ｑｉａｎ２， ＤＥＮＧ Ｙｕ－ｂｉｎ１， ＺＨＩ Ｗｅｉ２， ＸＩＥ Ｈｕｉ－ｑｉ２， ＤＥＮＧ Ｌｉ２， ＹＡＮＧ Ｚｈｉ－ｍｉｎｇ２， ＷＡＮＧ Ｙａ－ｚｈｕ１
（ １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ＳＵＮ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８９， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｕａｘｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ ）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ， ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｔｈｅｎ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（ １） Ｂｏｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ａｎｄ ５０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ （ ｏｎ ｄａｙ ７， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ３１．４％ ±２．１％ ａｎｄ １９．０％ ±１．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， Ｐ ＜ ０．０００１） ． （ ２） Ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ３－ ４ ｄａｙｓ， ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ． Ｌａｔｅｒ ｏｎ， ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｐｐｅａｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ８－ ９ ｄａｙｓ （ ｄａｙ９， ｔｈｅ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ４０．２％ ±１．３％ ） ． Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｇｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ａｎｄ ｅｎｄ ｉｎ
C2C12成肌细胞体外诱导分化为肌管的实验
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅｓ， ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ， ｔｈｅｎ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ， ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】（ １） Ｂｏｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ａｎｄ ５０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ （ ｏｎ ｄａｙ ７， ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ３１．４％ ±２．１％ ａｎｄ １９．０％ ±１．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， Ｐ ＜ ０．０００１） ． （ ２） Ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍＬ ／Ｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ３－ ４ ｄａｙｓ， ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｓｔａｒｔｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ． Ｌａｔｅｒ ｏｎ， ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｐｐｅａｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｎ ８－ ９ ｄａｙｓ （ ｄａｙ９， ｔｈｅ ｍｙｏｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ４０．２％ ±１．３％ ） ． Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｇｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ａｎｄ ｅｎｄ ｉｎ
关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象
关于骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象【关键词】骨骼肌关键词: 骨骼肌;细胞凋亡;细胞分化摘要:目的对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究. 方法本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成. 结果 C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象;而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象. 结论在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡.Keywords:skeletal muscle;cell apoptosis;cell differentia-tionAbstract:AIM To investigate apoptosis in the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells.METHODS Murine C2C12myoblasts differential model was used in this experiment;the changes of cell cycle was tested by flow cy-tometry;genomic DNA was extracted for analysis by elec-trophoresis;in situ end-labeling（ISEL）and electron micro-scope were used to detect the apoptosis.RESULTS After C2C12cells from cultures were incubated for24or48hours in differentiation medium，apoptosis was detected;but no apoptosis was found in control group and C2C12cells from cultures incubated for72hours in differentiation me-dium.CONCLUSION During the differentiation and devel-opment of skeletal muscle，a fraction of cells might be lost through apoptosis automatically，andthis may be related to the time.Differentiated myotubes are possibly resistant to apotosis.0 引言细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］ .凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］ .凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］ .C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mL L-1 胚牛血清的DMEM 培养基可诱导其分化［4］，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化［5］ .我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×10 5 L-1 ，接种于100mL L-1 胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mL L-1CO2 孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mL L-1 胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mL L -1 胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.1.2 方法1.2.1 流式细胞仪对细胞的检测按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×10 6 mL-1 ，4℃PBS洗涤，700mL L-1 冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μg mL-1 碘化丙啶，1mL L -1 Triton X-100，0.1mmol L -1 EDTA （Na）2 ，50μg mL-1 Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，>610nm滤色片检测，对细胞进行分析.1.2.2 TUNEL法按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μg mL-1 蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.1.2.3 电镜检测常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.1.2.4 DNA的电泳分析细胞经2.5g L-1 胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20g L-1 琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.2 结果2.1 肌细胞分化过程中细胞周期 C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）.图1 略2.2 形态学观察和TUNEL法染色光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合.对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）.图2 －图3 略2.3 电镜观察 GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）.2.4 细胞基因组DNA的电泳分析肌细胞于分化培养基培养24h、细胞出现梯状DNA，尤以48h悬浮细胞显著（Fig4）.图4 略3 讨论迄今已发现许多因素都可诱导细胞凋亡，生化机制还不十分明确［6］ .一般认为程序化细胞死亡过程中核DNA的降解是由于一种Ca2+ ，Mg 2+ 依赖性内切酶活化引起的［7，8］ .多细胞有机体的发生、发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合，即细胞周期的正常运行，细胞的增殖和凋亡的平衡.对肌肉细胞凋亡现象的研究将对揭示肌细胞恶变、老化、退变性肌病等的发病机制及其治疗有重要意义.FCM是检测细胞凋亡有效而灵敏的方法，为观察凋亡提供了新的手段［9］ ;凋亡细胞检测技术TUNEL法，是利用凋亡细胞生化特征的先进检测技术，具有很高的灵敏性.本实验中肌细胞分化的特定时期即肌母细胞在分化培养基培养24h和48h，TUNEL法染出了凋亡细胞，此外，DNA凝胶电泳分析出现反映核小体断裂的DNA梯状带.以上结果表明，在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，这在肌肉组织重建有积极的意义.另外，凋亡的发生具有明显的时间性，分化早期（24h）检测出凋亡细胞数量较少，可能原因是此期间为特异性基因开放期，分子水平反映活跃，形态改变不太显著;分化后期（72h）不再发生凋亡，主要原因在于诱导72h后肌母细胞已经融合形成肌管，肌管是终末分化的肌细胞，不能再进入细胞分裂周期.不过，最近有的学者SV40大抗原引入肌管，终末分化的肌管重新进入细胞周期，出现减数分裂和凋亡，说明肌管仍具有凋亡发生的机制［10］ .细胞凋亡时伴有多种基因转录和蛋白质合成.c-myc是调控细胞增殖的主要基因，c-myc的表达产物是一种转录因子，与细胞增殖分化及癌变有密切关系.Evan 等［11］选用大鼠成纤维细胞Rat1/myc为实验模型研究发现，当有某些因素（低血清浓度，抑制细胞周期因子，抑癌基因）存在时c-myc基因的表达与细胞程序性死亡密切相关.本实验在诱导肌细胞分化时采用20mL L-1 血清的DMEM培养基，c-myc可能在细胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的调节过程的机制仍很不清楚.总之，肌母细胞分化、发育的过程中出现凋亡现象可能为保证肌肉发育成熟所必须，为清除不再需要的肌细胞提供了一个有效机制，它的研究对于肌肉系统疾病认识将有很大帮助.参考文献［1］Miyashita T，Reed JC.bcl-2oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line ［J］.Blood，1993;8（1）:151-156.［2］Ueda N，Shah SV.Apoptosis ［J］.J Lab Clin Med，1994;124（2）:169-177.［3］Walsh K，Perlman H.Cell cycle exit upin myogenic differentia-tion ［J］.Curr Opin Genet Dev，1997;7（5）:597-602.［4］Qin RF，Gu XM，Zhang H.The affection of fetal bovine serum concentration on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro ［J］.Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi（J Pract Stomatol），2000;16（1）:14-16.［5］Qin RF，Gu XM，Huang FG，Zhang H.Analysis of cell cycle and DNA synthesis during myocytic differentiation by flow cy-tometry ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），2000;21（8）:921-923.［6］Telford WG，King LE，Fraker parative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associat-ed chromatin degradation by flow cytometry ［J］.Cytometry，1992;13（2）:137-142.［7］Surh CD，Sprent J.T-cell apoptosis detected in situ duringposi-tive and negative selection in the thymus ［J］.Nature，1994;372（6501）:100-103.［8］Zhivotovsky B，Wade D，Nicotera P.Role of nucleases in apop-tosis ［J］.Int Arch Allergy Immunol，1994;105（4）:333-338.［9］Telford WG，King LE，Pamela JF.Rapid quantitation of apop-tosis in pure and heterogeneous cell populations using 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植物源无血清培养基的研究进展
科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION0 引言与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取物，能支持细胞在体外长时间生长和繁殖，是继天然培养基和合成培养基之后的第三类培养基。
目前商业化的无血清细胞培养基有明显的特征区别，通常可分为4种类型：无血清培养基（Serum -free medium ，SFM ）、 无动物源培养基（Animal -component -free medium ，ACFM ）、无蛋白培养基（Protein -free medium ，PFM ）、化学成分限定培养基（Chemically defined medium ，CDM ）。
无血清培养基中没有添加血清，但会添加一些额外的成分来维持细胞的生长，因此，无血清培养基通常是由基础培养基和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白等添加因子组成。
在过去的几十年里，血清已经被各种成分所取代，如重组表皮生长因子（Epidermal growthfactor ，EGF ）、胰岛素、转铁蛋白、皮质醇，最常见的是牛垂体提取物（Bovine pituitary extract ，BPE ）用于培养贴壁角质形成细胞。
在基础培养基中添加血清的主要目的是提供促细胞生长成分，作为营养物质、激素、生长因子以及蛋白酶抑制剂，同时血清能够使细胞贴壁以及平铺在细胞瓶中，提供特殊的保护机制来避免细胞的机械损伤和剪切力，还可以抑制有毒部分对细胞的冲击，提高培养基的缓冲能力[1-3]。
血清中含有可以转运脂类、脂肪酸、激素和微量元素（尤其是铁元素）的白蛋白和转铁蛋白。
但是随着欧洲许多国家爆发疯牛病（Bovine spongiform encephalopathy ，BSE ），血清的应用受到越来越多的质疑。
由于批量使用的动物血清来源于自然生物体（主要是新生牛），它本身携带和采集、加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在作者简介：张凯茵，南京财经大学本科生，主要研究方向为粮油副产品生物转化技术。
棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用
第47卷第6期2021年11月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.47No.6Nov.2021DOI：10.13481/j.1671‑587X.20210606棕榈酸对骨骼肌细胞脂质沉积的诱导作用何勇,洪莉,黄国涛,赵芷涵（武汉大学人民医院妇产科，湖北武汉430060）［摘要］目的目的：探讨棕榈酸（PA）对骨骼肌细胞脂质沉积的作用及其最佳作用浓度和时间。
方法：在C2C12细胞生长至70%~80%时分为对照组和不同浓度（50、75、100和125μmol·L－1）PA组。
不同浓度PA组细胞采用含不同浓度PA的生长培养基培养，对照组细胞不给予PA（0μmol·L－1PA）。
CCK-8法检测各组细胞增殖活性，定量检测细胞中甘油三酯（TG）水平，油红O染色观察细胞中脂滴形成情况，2%马血清诱导细胞分化并评价各组C2C12细胞分化状态。
结果结果：与对照组比较，50、75和100μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性差异无统计学意义（P>0.05），125μmol·L－1PA组C2C12细胞增殖活性明显降低（P<0.01），50、75和100μmol·L－1PA组细胞中TG水平升高（P<0.01），100μmol·L－1PA组C2C12细胞中TG水平升高最明显（P<0.01）；与培养24h比较，100μmol·L－1 PA培养48h后，C2C12细胞中TG水平升高（P<0.01）。
分化培养后，PA组和对照组C2C12细胞中均有较多肌管形成。
结论结论：100μmol·L－1PA作用48h可有效促进C2C12细胞脂质沉积。
［关键词］盆底功能障碍；肥胖；高脂；棕榈酸；脂质沉积［中图分类号］R711.4［文献标志码］AEffect of palmitic acid on induction of lipid deposition inskeletal muscle cellsHE Yong,HONG Li,HUANG Guotao,ZHAO Zhihan（Department of Obstetrics and Gynecology，People’s Hospital，Wuhan University，Wuhan430060，China）ABSTRACT Objective：To explore the effect of palmitic acid（PA）on the lipid deposition in the skeletal muscle cells，and to discuss the optimum action concentration and time.Methods：The C2C12cells were divided into control group and different concentrations（50，75，100，and125μmol·L－1）of PA groups when the C2C12cells grew to70%－80%.The C2C12cells in different concentrations of PA groups were given growth media containing different concentrations of PA，while the C2C12cells in control group were not treated with PA（0μmol·L－1PA）.CCK-8method was used to detect the cell proliferation activities of cells in various groups，the triglyceride（TG）levels in the C2C12cells in various groups were detected，Oil Red O staining was used to observe the formation of lipid droplets in the C2C12cells in various groups，and2% horse serum was used to induce the cell differentiation and evaluate the differentiation of C2C12cells in various groups.Results：Compared with control group，there were no significant differences in the proliferation activities of the C2C12cells in50，75，and100μmol·L－1PA groups（P>0.05），the [文章编号]1671‑587X(2021)06‑1380‑06[收稿日期]2021‑02‑03[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81971364，81771562）[作者简介]何勇（1994－），男，湖北省恩施州人，在读硕士研究生，主要从事女性盆底功能障碍性疾病和妇科肿瘤方面的研究。
MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达
MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【摘要】以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHCl、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4d和第6d的表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6d和第8d表达水平显著高于其他天数(p＜0.05).【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(040)003【总页数】4页(P350-353)【关键词】肌球蛋白重链基因;C2C12成肌细胞;时序表达【作者】林亚秋;张明;邬杨楠;李瑞文;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;成都市妇女儿童中心医院生殖与不孕研究所,成都610051;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q593+.3骨骼肌是机体的重要组成部分, 肌纤维是组成骨骼肌的基本单位, 由成肌细胞分化而来, 其特性直接决定肉的品质, 是动物养殖的重要经济性状. 肌纤维特性主要包括肌纤维的类型、直径、密度及肌纤维生长发育规律等. 其中肌纤维类型的多样性以及复杂的时空分布模式是肌肉功能差异的分子基础, 不同类型的肌纤维在收缩功能、线粒体成分和代谢特性等方面有很大差异[1], 进而导致肌肉之间品质的差别[2]. 研究表明, 肌肉中红肌纤维所占的比例越大, 白肌纤维所占比例越小, 肌肉的品质就越好[3-5]. 1994年, Scohiaffin和Reggiani确定了哺乳动物中与肌纤维类型相对应的肌球蛋白重链MyHC的类型, 即肌球蛋白重链的亚型MyHCI(MyHCslow)、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb分别对应I型、IIa型、IIx型和IIb型肌纤维[6]. 目前肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)同功型被认为是决定肌纤维快、慢类型的主要决定因素[7], 是区分肌纤维类型和研究肌肉适应性的分子标志. 因此阐明MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达规律具有重要的意义. 本实验以C2C12成肌细胞为研究对象, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因在诱导分化的0-8 d成肌细胞中的表达规律, 研究结果为阐明动物肌肉生长及肉品质形成的分子机制提供重要的基本资料.1.1 实验材料和主要试剂实验所用C2C12成肌细胞系由本实验室保存.细胞培养基DMEM/F12、马血清购自Gibco公司; 胰蛋白酶(购自sigma公司), Trizol试剂、SYBR® Premix Ex Taq TM (2×)和pMD-19T载体购自大连TaKaRa公司; 反转录试剂盒和Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司;其他均为国产分析纯.1.2 方法1.2.1 C2C12成肌细胞的培养从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存管, 快速放于37 ℃水浴中, 轻摇1 min使其溶解, 然后加入10倍冻存液体积的培养基, 1050 rpm离心4 min, 弃上清, 将细胞接种于含10 %FBS的高糖DMEM培养基中, 在37 ℃, 5 %CO2的培养箱中静臵培养. 待细胞将长至90 %以上的时候进行传代, 在37 ℃、5 %的CO2培养箱中培养24 h, 第2天换为含2 %马血清高糖DMEM培养基诱导分化, 继续培养用于后续研究.1.2.2 细胞总RNA提取与反转录分别收集诱导0、2、4、6、8 d的C2C12成肌细胞, 吸出培养皿中的培养液. 按照Trizol试剂盒说明书提供的方法提取细胞总RNA, 紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量, 然后-80 ℃保存备用.取1 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书以Oligo (dT) 为引物合成cDNA第一链.1.2.3 荧光定量PCR根据小鼠MyHC1、2b、2x的mRNA基因序列(登录号分别为BC158018、AJ278733、DQ021871), 应用Primer Premier5.0软件, 设计MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因特异引物(表1), 送交上海生物工程股份有限公司合成. 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在不同分化时期的C2C12细胞中的表达规律. 反应体系为20 μL: SYBR® Premix Ex Taq TM(2×)PCR 10 μL , 10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, cDNA 1μL, 灭菌水8 μL. 反应条件为95 °C预变性1 min, 95 °C 30 s, 61 ℃/58 ℃ 30 s, 45个循环, 72 °C 延伸30 s. 荧光定量结果采用2-ΔΔCt方法进行分析[8].1.3 数据分析数据采用SPSS 13.0 软件进行分析, 所得数据用平均值±标准误( mean ± SE) 表示, 采用ANOVA进行显著性检验分析, 当P<0.05 时, 认为差异显著, 当P<0.01 时, 认为差异极显著.2.1 细胞总RNA的鉴定提取的细胞总RNA样品经紫外分光光度计测定, 其OD260/OD280值均在1.8-2.0之间, 表明细胞RNA无蛋白及酚污染. 且总RNA经1 %琼脂糖凝胶电泳显示RNA有28 S, 18 S, 5 S 3条主要区带, 说明样品中的RNA基本没有降解, 可用于后续分析.2.2 MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12细胞分化过程中的表达变化荧光定量PCR结果显示: MyHC1基因在0-4 d表达呈上升趋势, 在4-8 d又呈下降趋势, 但在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图1).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降(图2).MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05)(图3).肌纤维类型及其组成是肌肉生长和肉品质形成的生物学基础, 可直接影响肌肉色泽、嫩度和肌内脂肪含量, 因此备受动物育种工作者的广泛关注. 骨骼肌根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性分为两类, 即Ⅰ型(红肌, 慢肌)和Ⅱ型(白肌, 快肌)肌纤维. Ⅰ型含有更多的线粒体和细胞色素, Ⅱ型细胞色素和肌红蛋白含量较少. 后来学者指出MyHC的亚型可决定肌纤维的类型, 是分子水平上的主要检测指标[9]. 本实验以2 %的马血清诱导C2C12细胞分化, 分别收集诱导0-8 d的细胞, 利用荧光定量PCR检测MyHC1、MyHC2x和MyHC2b的表达规律, 结果指出这些基因在分化过程中具有一定的表达规律, MyHC1基因在分化的前期表达呈上升趋势, 在分化后期表达水平开始下降, 在第4 d表达最高(p<0.05); MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达是呈上升趋势, 但在第8 d又开始下降,在第6 d表达水平最高. MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势, 在分化后期表达水平高. 这一实验结果与肌肉本身的生长发育特性、生理变化规律是基本相符的[10,11]. 这与杨晓静等[12]的研究结果相似, 3日龄猪MyHC1和MyHC2x的表达水平显著高于20日龄及以后猪的表达水平,MyHC2b在20日龄猪的表达水平显著高于3日龄猪的表达水平. 总之肌纤维类型的组成在动物生长发育的整个时期受各种外界因素的影响会发生肌纤维类型转化的现象[13-15], 对动物肉品质的形成具有很大的影响, 因此研究肌纤维类型的转化及其调控机制将是一个十分有价值的课题.【相关文献】[1] BERCHTOLD M W, BRINKMEIER H, MUNTENER M. Calcium ion in skeletal muscle: its crucial role for muscle function, plasticity, and disease[J].Physiol Rev, 2000, 80:1215-1265.[2] PICARD B, JURIE C, DURIS M P, et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livest Sci, 2006, 102: 107-120.[3] LEFAUCHEUR L, MILAN D, ECOLAN P, et al. 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成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞，具有很强的增殖和分化能力。
小鼠成肌细胞系C2C12细胞由Yaffe等[[83]克隆建立，体外培养的C2C 12细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达myosin 和myogenin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白。
因此，C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化的首选模型。
C2C12细胞的生长特性
相差倒置显微镜下，刚传代的C2C12细胞呈球形或椭圆形，有折光性，30 min后开始贴壁，8h后贴壁完全。
贴壁后的C2C12细胞呈梭形，单核，位于细胞中央。
起始4.0×104了个细胞接种于直径为35 mm的细胞培养皿，3d后达80%左右汇合，4d后几乎占据培养皿所有细胞生长表面，继续培养则相邻细胞变长并相互融合，肌小管形成增多。
（80%）
待细胞在完全生长培养液(DMEM/10% FBS/S/P)生长至80%左右汇合时，换成分化培养液(DMEM/2% HSISJP)后，大量细胞开始融合成肌管，分化培养3d后，肌管大量形成，之后肌管进一步增长增粗。
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精品。