免疫共沉淀Co-IP实验步骤

WB技术

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

Co-IP实验步骤

免疫共沉淀实验步骤：1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。

2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。

（阴性对照组为相同的种属的抗体）3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。

用IP buffer洗涤3次，每次4℃12000rpm离心5min，弃上清。

加入40μl 2×上样缓冲液。

沸水中煮10 min变性蛋白。

取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。

IP buffer20mM Tric-Hcl137mM NaCl10% Glycerol1% Np-401mM EDTA注意事项：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。

(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

（8）如何选择prorein A/G 树脂见abcam IP 实验步骤。

免疫共沉淀Co-IP实验步骤

免疫共沉淀Co-IP实验步骤Co-IP实验步骤一、制备细胞样品1.10cm盘细胞用PBS清洗两次，加入1mL RIPA裂解液和10μL PMSF（100mM稀释至1mM）；2.充分混匀吹打后，冰上裂解4h，充分吹打吸入1.5mL EP管中，-80℃保存；3.取出样品，1200rpm离心10min，取上清弃沉淀，测定蛋白浓度。

二、Co-IP，拉出蛋白1.每管取出少量蛋白样（15~30μL）作为input；2.将磁珠充分混匀后，取出50μL于1.5mL EP管中，置于磁力架上，弃上清。

（有几个样品就准备几管）；3.加入200μL Ab binding&washing Buffer（可用PBST代替），加入对应抗体，加入后轻弹混匀，360°混合仪上旋转30min；4.500rpm离心使管壁液体下来，弃上清，200μL PBS清洗（旋转5min）；5.加入1000μg 蛋白样品于EP管中，轻弹混匀，旋转1h，弃上清；6.加入200μL was hing buffer（或PBST）清洗3次；7.加入100μL washing buffer 悬浮磁珠并将溶液转移至新的EP 管中；8.弃上清，加入6μL 5×loading buffer，24μL Elution buffer （或ddw，洗脱液）；9.100℃煮10min，吸取上清；10.进行WB或SDS-PAGE。

注意事项：1.标记：样品名+抗体名；2.抗体上必须标有“IP”字样，有推荐用量；3.Co-IP中pull down 抗体与WB抗体的来源（M,R）必须不同；4.PBST=PBS + 0.02% 吐温。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose 的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP )protocal 操作流程

Co-IP ProtocolOverview:Day1 45min1.复苏2.铺板（晚上）Day2 40min3.转染（上午）4.换液（6小时候）Day4 1h5.48hr收细胞6.Co-IP(day1)到加抗体O/N7.Co-IP(day2) Day5 3-4h8.WB(day1)至一抗孵育Day5 or Day6 all day9.WB(day2),显影Day6 3-4hProcedures:1.Co-transfect myc-A and HA-B in 6 wells；2.Aspirate the medium and wash with PBS once (Careful not to the shake the cells off)；3.Harvest cells on ice with PBS+1%triton+Protease Inhibitor(100x) 300µl per well；4.Move liquid to 1.5ml EP tube；5.ice bath，Sonicate 8 strokes， 3-4 times every tube，open 2 secs，stop 2 secs；6.Rotate in cold room rotor for 20min；7.Centrifuge at max speed 20min, at 4°C；8.Collect supernatant. Get OFFER ( get 56 µl，add 14 µl 5xLoading Dye )。

OPTIONAL: PRECLEAR9.Pre-clear 150 µl supernatant with 60 µl protein-G beads for 1hr in cold room rotor.10.Centrifuge at 5000 rpm for 1 min at 4°C.11.Transfer the supernatant to a new tube.12.Add 2 µl of myc-Ab to IP；adding PBS to 800µl；13.Incubate O/N in cold room rotor；14.Add 60~100 µl of Protein-G beads；15.Incubate 2hrs in cold room rotor；16.Centrifuge 5,000rpm for 15min at 4°C；17.Wash with PBS + 1% triton for 4 times，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for2-5min at 4°C；18.Wash three times with PBS，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for 2-5min at4°C；19.Elude protein with 65 µl of 5x SDS loading buffer；20.Boil for 5 mins；21.Load 20 µl per hole to run western-blot for myc, HA and stim1。

coip免疫共沉淀实验步骤

coip免疫共沉淀实验步骤
嘿，咱今儿就来唠唠这 coip 免疫共沉淀实验步骤哈！
首先呢，得把咱要用的细胞或者组织啥的准备好呀，这就好比做饭得先有食材不是。

然后呢，用合适的裂解液把这些细胞或者组织给裂解咯，让里面的蛋白质啥的都释放出来，这就像是把食材给切好准备下锅。

接下来，把裂解液和抗体加一块儿，让抗体去抓住它要找的目标蛋白，这就跟警察抓坏人似的，抗体就是那个厉害的警察，专门找它要抓的那个坏蛋蛋白。

等抗体抓住目标蛋白啦，咱就得想办法把它们给弄出来呀。

这时候就得用上一些特殊的珠子啥的，这些珠子能和抗体结合，就像磁铁吸铁一样，一下子就把带着目标蛋白的抗体给吸过来啦。

吸过来之后呢，可不能就这么不管啦，得好好洗一洗，把那些杂七杂八的不要的东西给洗掉，留下咱要的目标蛋白和跟它结合的小伙伴们。

洗完了，那就该看看成果啦！可以通过一些方法来检测咱是不是真的抓到了目标蛋白，还有它带没带着它的小伙伴们。

哎呀，你说这实验是不是挺有意思的呀！就像一场奇妙的探险，去寻找那些隐藏在细胞里的秘密。

做这个实验可得细心哦，每一步都不能马虎，就像盖房子，一块砖没砌好可能房子就不结实啦。

裂解液得选对，抗体得靠谱，珠子也得质量好，不然怎么能抓住咱想要的东西呢。

而且啊，做实验的时候还得有耐心，不能着急，一步一步慢慢来，可别像个毛躁的猴子，东一下西一下的。

总之呢，coip 免疫共沉淀实验虽然有点复杂，但只要咱认真对待，按照步骤一步一步来，肯定能发现好多有趣的东西。

咱搞科研的不就是为了探索那些未知的秘密嘛，这实验就是咱探索的好工具呀！大家加油干，让咱们在科学的海洋里畅游，发现更多的惊喜！。

[重点]Co-IP实验步骤

免疫共沉淀实验步骤：1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。

2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。

（阴性对照组为相同的种属的抗体）3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。

用IP buffer洗涤3次，每次4℃12000rpm离心5min，弃上清。

加入40μl 2×上样缓冲液。

沸水中煮10 min变性蛋白。

取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。

IP buffer20mM Tric-Hcl137mM NaCl10% Glycerol1% Np-401mM EDTA注意事项：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Trito n X-100)。

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。

(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。