免疫学实验-多克隆抗体的制备
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
免疫学实验：多克隆抗体制备-免疫小鼠
分组情况
免疫程序
组别 时间
Day 0 皮下注射
Day 10 皮下注射
Day 17 腹腔注射
有佐剂组
无佐剂对照组 阴性对照组
40ugOVA 弗氏完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 40ugOVA 40ugOVA
生理盐水 生理盐水 生理盐水
Day 24
取血
取血
取血
颈部皮下注射要点
❖ 拇指与食指捏起颈部皮肤 ❖ 水平进针，针头脱空感，缓慢注射，迅速拔出
腹腔注射要点
❖ 抓住颈部皮肤和鼠尾，将小鼠翻转，头部偏下 ❖ 45度进针，靠近腹部中线，进针1cm针头脱空感，缓慢注
射，迅速拔出
注意事项
❖ 戴手套操作 ❖ 注射器针头用后及时盖帽 ❖ 文字记录标记方法 ❖ 经常检查标记保存状况
JLU
JLU
多克隆抗体制备-免疫小鼠
实验材料
❖ 小鼠 每组3只 ❖ 注射器 每组3只 ❖ 乳胶手套 每人1付 ❖ 线手套 每组1付 ❖ 记号笔、手术剪刀 公用 ❖ 弗氏注射液 公用 200ug/ml OVA in 弗氏佐剂 ❖ 无佐剂注射液 公用
200ug/ml OVA in 生理盐水 ❖ 生理盐水（对照） 公用
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
17多克隆抗体制备——动物免疫
多克隆抗体制备多抗制备通常用抗原免疫动物，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后通过获取动物高免血清获得抗体；获得的高免血清大部分可以直接使用，用于普通免疫学实验，有些则需要机一部纯化修饰才可以使用。
一、动物免疫动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。
下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。
程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次）天数佐剂类型免疫程序剂量（质量/体积）兔子小鼠大鼠豚鼠山羊鸡0 完全佐剂预取血（血清背景检测）首次免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl20 不完全佐剂第一次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl40 不完全佐剂第二次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl60 不加佐剂第三次加强免疫(静脉)100μg/500μl40μg/50μl100～500μg100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl70 终放血1.动物的准备及背景测试选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。
1.2 兔耳静脉取血方法耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。
1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来；1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用二甲苯擦拭，使其血管膨胀。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
实验一多克隆抗体的制备(颗粒性抗原)
上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（颗粒性抗原）实验日期2011年9月至10月基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.单克隆过夜培养的坂崎肠杆菌，用灭菌生理盐水洗涤后，反复冻融3~5次，-20℃保存；3.消毒酒精及碘酒。
免疫方法1.第一次免疫: 用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
2.第二次免疫: 间隔14天后再用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
3.间隔14天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以凝集反应试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
4若效价未达到要求，可再次进行加强注射，隔14天后再试血。
放血颈动脉放血将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
分离血清将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。
待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。
于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
免疫学实验报告1
免疫学实验报告姓名:买迪来木.坎代尔学号:201020131222 班级:2010131实验一：多克隆抗体的制备和抗体效价的检测一：实验原理有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好的抗体。
质量好的抗体的标准：特异性强和效价高多克隆抗体的概念：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。
机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。
多克隆抗体产生的基本原理：初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。
机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。
在 Mø 和 Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆 B 细胞（Bm）。
浆细胞产生特异性抗体。
由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。
随着抗原的消耗，抑制 T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。
二次反应产生的抗体主要是高亲和力的 IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的 Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。
Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用 1~2 天后，抗体滴度迅速上升。
抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
1.用于免疫的动物用于免疫的动物可以是哺乳类和禽类，可以是羊、马、兔、鸡等，实验室常用兔、山羊和豚鼠。
动物种类的选择标准：1.根据抗原的生物学特性和所需获得的抗血清数。
2.用于免疫的动物需适龄、健壮、无感染性疾病，最好为雄性。
3.十分注意动物的饲养，消除动物个体差异及在免疫过程中死亡的影响。
4.如果用兔子，最好用纯种新西兰兔，一组三只，体重2-3kg为宜。
2.免疫途径：途径有很多种：静脉注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射、淋巴结内注射等。
一般选择多点皮内或背部注射，每点注射0.1ml左右。
免疫学实验 实验一多抗制备
a.根据抗原性不同，分为完全抗原和不完全抗原。 b.根据化学性质分为蛋白质抗原、类脂抗原、多糖抗 原和核酸抗原。
c.根据物理性状分为颗粒性抗原和可溶性抗原。常见 的颗粒性抗原主要是细菌或动物细胞。
B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。
• 多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地
就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂 在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多 原的制备与纯化 • 动物免疫 • 血清分离纯化与鉴定
1.抗原的制备与纯化
• 抗原：是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体 或T细胞受体发生特异反应的物质。具有免疫原性和 免疫反应性。
接种 37℃ 18-24h
洗下菌苔
（用含0.5%苯 酚的NS）
100℃ 45min
离心
4000rpm,10min
得到原液
稀释
109/ml应用液
2、免疫方法：
选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀 释好的抗原按下列剂量及程序做皮内或 静脉注射。第一天注射1ml，第8天注射 1ml，第15天注射2ml，末次注射后7天 颈动脉放血，测效价。
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
周可
4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 45min杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图 O菌体抗原
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2.动物的选择
• 动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也 与抗原的性质有关。
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JLU免疫学实验-多克隆抗体的制备吉林大学生命科学学院生物实验教学示范中心王飞 fei@内容提要抗体的产生及免疫功能1抗体的临床及科研应用2抗体制备原理3ELISA法测定抗体效价4实验项目简介5免疫系统概述Immune system：protect against diseaseMajor target: detect and distinguish pathogens (virus, bacteria, fungi, parasite, others)Innate/固有 immune system: nonspecific rapid (leukocyte, NK cell, complement)scavenge recruit activateAdaptive/适应性immune system: specific slow (lymphocyte, antibody)recognize tag memory免疫反应时间线概念抗原(antigen)：能刺激机体免疫系统产生抗体和/或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合而出现反应的物质。
抗体(antibody)：机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞所产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。
抗体的产生及功能抗体的产生：B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。
抗体的免疫学功能：识别病原菌表面抗原阻止病原菌侵袭体细胞介导特异性免疫攻击抗体的科研应用免疫沉淀 免疫共沉淀免疫印迹免疫荧光染色流式细胞术 7 抗A 抗B 待测红细胞悬液 --O ++AB +-B -+A 抗B抗A 诊断血清血型抗体的临床应用检测待测抗原妊娠检测 血型鉴定 病原菌鉴定 ELISA 癌症靶向治疗直接激活NK 细胞 挂载药物抗体制备的目标抗体制备原理首次免疫：B细胞活化为浆细胞和记忆B细胞，浆细胞分泌抗体，IgG含量不高。
首免响应速度慢，延迟期6-10天。
再次免疫：2-4次，激活体液中驻留的记忆B细胞，分化为浆细胞并分泌抗体，IgG含量高。
再免响应速度快，延迟期短。
免疫间隔：首免与二免间隔10天以上，确保记忆B细胞产生。
再免间隔不固定，一般是7天。
抗体制备的收集对象：再免激活的浆细胞（单抗制备）再免产生的抗体（多抗制备）抗体制备原理11抗体制备的产物类型抗原决定簇（epitope / antigenic determinant）：抗原表面能够被抗体特异识别的约6个氨基酸或糖基组成的结构域。
12抗体制备的产物类型单克隆抗体（monoclonal antibody ）：由一种浆细胞产生的，只识别一种抗原决定簇的抗体。
多克隆抗体（polyclonal antibody ）：由多种浆细胞产生的，识别同一抗原的多个抗原决定簇的多种抗体的集合.13杂交瘤细胞融合技术B细胞：能分泌抗体，无法增殖。
骨髓瘤细胞：能永久传代。
杂交瘤细胞：能分泌抗体，能永久传代。
聚乙二醇（PEG）融合剂HAT筛选（第一次筛选）抗原筛选（第二次筛选）HAT选择DNA合成途径：主要途径，替代途径HAT培养基：抑制主要途径B细胞：具备替代途径，无法增殖，自然死亡。
骨髓瘤细胞：替代途径缺失，无法生长。
杂交瘤细胞：DNA替代途径正常，具备增殖能力，稳定传代.免疫佐剂佐剂（adjuvant ）：一类非特异性免疫增强剂，先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
作用原理：增加滞留时间、增强机体免疫敏感性 佐剂种类很多，见百度。
弗氏佐剂（Freund’s adjuant）抗体制备时常用的佐剂弗氏不完全佐剂羊毛脂+液体石蜡弗氏完全佐剂羊毛脂+液体石蜡+卡介苗首次免疫用完全佐剂，再次免疫用不完全佐剂。
羊毛脂、液体石蜡：油包水乳液，增加滞留时间。
卡介苗：增强免疫系统敏感性。
提升抗原递呈能力。
多克隆抗体的分离与纯化抗血清的制备：取血，离心亲和层析纯化：ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。
抗原亲和纯化，特异抗体。
单克隆抗体分离与纯化杂交瘤细胞体内培养：取腹水杂交瘤细胞体外培养：收集培养基上清亲和层析纯化：ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。
抗原亲和纯化，特异抗体。
JLU酶联免疫吸附测定ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)酶联免疫吸附实验原理：在固相载体上包被抗原，用相应的抗体与之识别，形成锚定在固相载体上的抗原-抗体复合物。
复合物内暴露在最外端的抗体为酶标抗体，在加入相应底物后可以催化底物的生色反应，进而通过分光光度计的度数来判断复合物的生成量。
ELISA分类直接法间接法双抗夹心法直接法1.Antigen is passively absorbedto solid phase by incubation2.Antibodies are added and incubated with solid-phaseattached antigen. Those which are specific will bind toantigenExcess antibodies or non-binding componentsare washed away after incubation phase3.Antibodies labeled with enzyme(conjµgate) directed against the particµLar species in which the original antibodies were produced(anti-species).4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation5.Substrate/chromophore is added and color develops as a resµLt of enzyme present.After a period of incubation of the colour development is ptopped and read by spectrophotometer 间接法双抗夹心法间接法ELISA测定抗体效价抗体效价：抗体样本与特定抗原间亲和能力的直接评价指标。
抗体效价由两方面因素决定：有效抗体的数量抗体与抗原表面决定簇间的亲和能力间接法ELISA是目前测定抗体效价最常用的技术间接法ELISA测抗体效价流程固相载体-包被ELISA中可用的固相载体的材料有很多，最常用的是聚苯乙烯（Polystyrene）非特异物理吸附：疏水相互作用包被缓冲液：PH9.6 >PI 负电表面抑制蛋白间相互作用封闭洗涤封闭：非特异蛋白封闭未被抗原覆盖的固相载体表面。
牛奶 BSA洗涤：去除非特异识别的抗体，降低背景。
温和表面活性剂：Tween-20催化生色反应的酶辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) DH2+ H2O2→ D+ H2ODH2为供氢体， H2O2为受氢体常用供氢体：邻苯二胺(OPD) 490nm吸收峰四甲基联苯胺(TMB)2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）酸性条件反应终止效价判定抗体效价:▪二倍于阴性对照OD值所对应的抗体稀释度稀释度（倍）4000 8000 16000 32000 64000 128000 256000 阴性对照OD值0.4 0.350.3 0.25 0.2 0.15 0.11 0.08抗体效价：64000-128000受限于实验条件，不做线性回归，不计算准确效价。
实验项目简介-内容制备鸡卵清白蛋白（OVA）的鼠源多克隆抗体 酶联免疫标记技术（ELISA）检测多克隆抗体的效价实验项目简介-流程首次免疫 Day 0二次免疫 Day 14三次免疫 Day 21取血制备血清梯度稀释血清 Day 28ELISA法测效价具体操作信息见《课前讲解》pptJLU免疫小鼠课前讲解材料及分组情况小鼠每组3只注射器每组3只乳胶手套每人1付(用于三次注射)线手套每组1付记号笔、手术剪刀公用有佐剂注射液公用200ug/ml OVA in 弗氏佐剂无佐剂注射液公用200ug/ml OVA in 生理盐水生理盐水（对照）公用免疫程序组别时间有佐剂组无佐剂对照组阴性对照组Day 0 皮下注射40ugOVA弗氏完全佐剂40ugOVA 生理盐水Day 14 皮下注射40ugOVA弗氏不完全佐剂40ugOVA 生理盐水Day 21 腹腔注射40ugOVA弗氏不完全佐剂40ugOVA 生理盐水Day 28 取血取血取血分组情况颈部皮下注射要点拇指与食指捏起颈部皮肤水平进针，针头脱空感，缓慢注射，迅速拔出腹腔注射要点抓住颈部皮肤和鼠尾，将小鼠翻转，头部偏下45度进针，靠近腹部中线，进针1cm针头脱空感，缓慢注射，迅速拔出注意事项戴手套操作注射器针头用后及时盖帽文字记录标记方法经常检查标记保存状况JLUELISA法检测抗体效价课前讲解间接法ELISA测抗体效价流程材料及试剂成分96孔ELISA板、移液器、镊子、离心管抗原包被液：50ug/ml OVA in 0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6封闭液：5%脱脂奶粉 in PBS pH7.4抗体稀释液：PBS pH7.4二抗：HRP标记羊抗鼠抗体, 1:5000 稀释洗涤液(PBST)：0.1%Tween-20 in PBS pH7.4显色液：0.04%OPD、0.15%H2O2 in 柠檬酸-磷酸缓冲液 pH5.0 终止液：2M硫酸取血摘取小鼠眼球，用1.5ml EP 管接血。
4000rpm ，离心5分钟，吸取上清（血清）待用。
拉颈处死小鼠。
抗血清梯度稀释1/200 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/64000 1/128000 1/256000 5µL 抗体(血清)500µL 抗体稀释液 (PBS) 50µL 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL 500uL1 2 3 4 5 6 7 8 995µL 抗体稀释液（PBS ） 三种抗血清各做一套稀释梯度 950µL抗体稀释液（PBS ）ELISA步骤包被: OVA抗原(50ug/ml) 100µL/孔, 4 ℃过夜.（已完成） 封闭：弃上清, 加入封闭液 150µL/孔, 37℃，30min.洗涤: 弃封闭液，加洗液200ul/孔，弃上清，洗一次 .一抗: 弃上清, 加入不同稀释度的待测血清抗体100µL/孔37℃，30min. 黄洗涤: 弃一抗，加洗液200ul/孔，弃上清，洗三次 .酶标抗体: 加入HRP标二抗100 µL/孔37℃ 30min.黄洗涤: 弃二抗，加洗液200ul/孔，弃上清，洗三次 .显色: 加入底物100 µL/孔，避光约15min（观察颜色）黄 加终止液: 加2M硫酸 50 µL/孔。