实验二十三 土壤硝化作用强度的测定
矿化、硝化与反硝化实验方法
土壤矿化、硝化与反硝化1.矿化培养矿化培养试验采用风干土淹水密闭培养法，预培2 周来消除干土效应。
称取过20 目筛风干土5g，每层土样称取3份，分别置于10×180 mm 的试管中。
将试管平放于桌面上小心滚动，使管中土面倾斜，用移液管缓缓加入5 ml去离子水。
加水后检查各试管中的土壤是否完全润湿，并尽量驱出土中的空气，然后用橡皮塞密封管口，置于25o C 的培养箱中恒温培养，约每周换气一次，并驱除土中气体（在培养后期换气的时间间隔可长一些）；分别于淹水后第0 周、1，3 周、5 周、7 周、10 周、14周时进行取样测定土壤中的铵态氮的含量，每层土样测定3 管，作为3 个重复。
测定时用20ml 2.5 mol/L KCl 将管中土壤全部洗入100ml 三角瓶中，振荡1 小时后静置半小时过滤，将滤液储存在塑料瓶中备测。
(1)每个培养管吸取培养溶液：5ml去离子水(2) 培养周期：预培2 周，分别于淹水后第0 周、2 周、4 周、6 周、8 周、10 周和12 周时进行取样测定土壤中的铵态氮的含量，每层土样测定3 管，作为3 个重复。
(3) 培养结束处理：测定时用20ml 2.5 mol/L KCl 将管中土壤全部洗入100ml三角瓶中，振荡1 小时后静置半小时过滤，将滤液储存在塑料瓶中备测。
2.土壤硝化试验方法如下：称取5g 过20 目筛的每层供试土样各2份，分别放入10×180 mm 的试管中，其中0天培养则不加铵，另外第7天、14 天、21 天和28 天分别取样的分别加入1.125 mgN (NH4)2SO4溶液，然后加水至田间持水量的80％，瓶口用塑料薄膜封口以减少水分损失，称重后置于25o C 的培养箱中恒温培养。
预培3 天后，对不加铵的分别加22.7ml 2.2mol/L KCL 溶液，振荡1 小时后，过滤到干净的塑料瓶中，测定铵态氮和硝态氮的含量作为初始量；而对加铵培养瓶称重，通气30 分钟并补充水分至原重，然后继续恒温培养，并开始计算时间，每隔3 天对加铵培养瓶通气一次并称重补充水分至原重，在正式培养后的第7天、14 天、21 天和28 天分别取样，每层土样各取3 瓶作为3 个重复，分别加25ml 2 mol/L KCL溶液，振荡1 小时后，过滤到干净的塑料瓶中，测定铵态氮和硝态氮的含量。
实验二十三 土壤硝化作用强度的测定
实验二十三硝化作用强度的测定硝化作用强度的测定◆目的要求◆实验材料◆试验程序◆土壤硝化作用强度◆思考题目的要求掌握硝化作用强度的测定方法，从而使学生进一步了解土壤中氮素如何有效利用及对环境污染的影响。
◆样品：新鲜土壤。
◆培养基：硝化作用第二阶段用培养基，药品用分析纯。
配方如下：NaNO2 1gMgSO4·7H2O 0.03gMnSO4·4H2O 0.01g K2HPO40.75g NaCO3(无水）1g NaH2PO40.25g CaCO3 3.0g 蒸馏水1000mL◆格利斯试剂：1. 溶液Ⅰ 称取对氨基苯磺酸0.5g,溶于150ml30%醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
2.溶液Ⅱ 称取α－萘胺0.5g,加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150mL,保存于棕色瓶中。
◆亚硝酸银标准液称取1.5000g分析纯亚硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入1000mL容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀。
用时以此液稀释成标准液（每mL含0.01mg的NO2-)其它：容量瓶（50mL、100mL、1000mL）、移液管（1mL、5mL）、三角瓶、漏斗、滤纸、玻棒、洗瓶等及分光光度计。
实验程序◆培养基的配制及1/10土壤悬液的制备◆接种培养◆用比色法测定虑液中的亚硝酸银含量实验程序1 (培养基的配制及1/10土壤悬液的制备)◆在150mL三角瓶中装30mL硝酸细菌培养基(要准确称量),灭菌,每组2只.◆在150mL三角瓶中装45mL蒸馏水,并放入少许玻璃珠灭菌,每组1只.◆1/10土壤悬液的制备称5g土壤放入装有45mL带玻璃珠的三角瓶中,振摇5min。
（接种培养）◆吸取1/10土壤悬液1mL接种到硝酸细菌培养基中，每组接2只三角瓶过滤立即用以测定原始培养液中亚硝酸根含量，另一支三角瓶置于280C 温室中培养15d.◆培养结束，取出三角瓶，培养液进行过滤。
(用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量）◆取滤液1mL于50mL容量瓶中，稀释至约40mL，加入1mL格利斯试剂Ⅰ，放置10min。
土壤硝化作用强度测定
土壤硝化作用强度测定
一、原理
将定量的土壤接种到硝化细菌培养基中，由于土壤中硝化细菌的作用，是亚硝酸氧化成硝酸，用培养基中亚硝酸的消失量占原始培养基中亚硝酸含量的百分比作为硝化作用强度的指标。
亚硝酸能与格利斯试剂反应产生一种紫红色的化合物，该显色反应不易受硝态氮的干扰。
二、药品器材
1.硝化细菌培养基：NaNO2 1g MgSO4·7H2O 0.03g MnSO4·4H2O 0.01g K2HPO40.75g
Na2CO3(无水)1g NaH2PO40.25g超纯水1000ML
2.格利斯试剂：溶液一，称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30%）中，保存于棕色
瓶中。
溶液二，称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30%的醋酸溶液150ml，保存于棕色瓶中。
3.亚硝酸根标准溶液：称取 1.500g分析纯亚硝酸那于烧杯中，加蒸馏水溶解后定容至
1000ml，此溶液亚硝酸根离子浓度为1mg/ml。
用时以此液配成亚硝酸根标准溶液（亚硝酸根离子浓度为0.01mg/ml）。
三、步骤
1.在150ml三角瓶中装30ml硝化细菌培养基，灭菌。
2.冷却后的培养基中接种1/10土壤悬液1ml，于28℃恒温培养15d，取出三角瓶过滤。
3.用比色法测定滤液中的亚硝酸含量。
四、硝化作用强度
硝化作用强度=（原始培养基中亚硝酸根含量-培养后培养基中亚硝酸根含量）/原始培养基中亚硝酸根含量*100%。
稳定性肥料中硝化抑制剂作用效果的检测方法
稳定性肥料中硝化抑制剂作用效果的检测方法发布时间：2021-04-26T10:40:08.337Z 来源：《基层建设》2020年第33期作者：李保荣[导读] 摘要：通过特定的过程，在肥料造粒过程中，添加尿素酶抑制剂和（或）硝化抑制剂以形成稳定的肥料，延迟施用于土壤的尿素的水解，进一步抑制铵态氮向硝酸态氮的转化，和氮可以减少。
哈密市质量与计量检测所新疆哈密 839000摘要：通过特定的过程，在肥料造粒过程中，添加尿素酶抑制剂和（或）硝化抑制剂以形成稳定的肥料，延迟施用于土壤的尿素的水解，进一步抑制铵态氮向硝酸态氮的转化，和氮可以减少。
一种含氮肥料，可延长挥发性肥料的保质期。
这种肥料可以减缓尿素的水解，抑制NO-3的形成，使土壤中的氮素保持更长的时间，并提高尿素的有效性。
它的关键作用是稳定化肥抑制剂。
硝化抑制剂通过抑制土壤中硝化细菌和硝化细菌的活性来减缓NH+4-N向NO-3-N的转化。
因此，检查硝化抑制剂在稳定的复合肥料中的抑制作用非常重要。
本文就此展开了探究。
关键词：稳定性肥料；硝化抑制剂；农业生产引言化肥是农业可持续发展的物质保证，是农业生产的基础。
氮素是作物在生长发育过程中需求量最多的矿质元素，是影响作物产量的首要因素。
目前，我国氮肥利用率不高，其中有很大一部分氮素会从农田系统进入到外部环境中，这不仅造成了肥料浪费，还带来了农田氮污染[1]。
有研究表明，在农业生产上，除合理施用氮肥、深施氮肥和分次施氮等方法能提高氮肥的利用率外，添加肥料增效剂[如通过施用硝化抑制剂（NP），可调控氮素的转化，减缓硝化过程，也是实现氮肥高效管理与利用的有效手段。
而硝化抑制剂的施用效果，除受自身性状和土壤微生物的影响外，还受土壤质地、有机质含量、水分、温度和土壤pH等因素的限制。
1材料与方法1．1材料供试土壤中国科学院沈阳生态基地的棕壤，吉林省农业科学研究所的黑土，吉林省白城市的浅黑土，江西南昌的红土。
除去杂质后，风干并通过2毫米筛子粉碎以使用。
(新)土壤硝化作用强度的测定
实验程序3
(用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量）
结果计算
NO2-(mg/30mL)=X(mg/mL) ×比色体积×稀 释倍数 ×10－3
式中X(mg/mL）——由标准曲线查知 10－3——换算为mg
土壤硝化作用强度
计算公式：
原始培养基中NO2- 量－培养基中NO2- 量 硝化作用强度＝ ×100％ 原始培养基中NO2- 量
思考题
什么叫硝化作用？硝化作用由哪
两类细菌参与？ 根据硝酸细菌培养基的组成成分， 硝酸细菌属何种营养类型？ 本实验的原理是什么？ 实验中要注意什么？
实验二十三
结
束
菌培养基中，每组接2只三角瓶过 滤立即用以测定原始培养液中亚硝 酸根含量，另一支三角瓶置于280C 温室中培养15d. 培养结束，取出三角瓶，培养液进 行过滤。
实验程序3
(用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量） 取滤液1mL于50mL容量瓶中，稀释至约 40mL，加入1mL格利斯试剂Ⅰ，放置 10min。再加入1mL格利斯试剂Ⅱ和 1mL2%醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度， 放置10min后，用分光光度计（波长 520nm)比色测定。 亚硝酸银标准曲线的绘制 吸取压硝酸银 标准液0、1、2、3、4、5mL，分别放 入50mL容量瓶中，定容。与待测样品同 样条件进行比色，以浓度为横坐标，以光 密度为纵坐标绘制标准曲线。
实验材料2
格利斯试剂： 1. 溶液Ⅰ 称取对氨基苯磺酸0.5g,溶于 150ml30%醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。 2.溶液Ⅱ 称取α－萘胺0.5g,加入50mL 蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸 溶液150mL,保存于棕色瓶中。 亚硝酸银标准液 称取1.5000g分析纯亚 硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入 1000mL容量瓶中 ，再加蒸馏水至刻度， 摇匀。用时以此液稀释成标准液（每mL含 0.01mg的NO2-)
硝化作用强度的测定
6.亚硝酸根标准曲线的绘制，吸取亚硝酸根标准液0、1、2、3、4、5ml分别放入50ml容量瓶中，定容，与待测样品同样条件进行比色，以浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线。
三、实验步骤
培养基的配置及1/10土壤悬液的制备-----接种培养-----用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量。
1.在150ml三角瓶中装30ml硝酸细菌培养基，灭菌每组2瓶。
2.在150ml三角瓶中装45ml蒸馏水，并放入少许玻璃珠，灭菌每组1瓶。
3.称5g土于45ml三角瓶中，震荡5分钟。
4.取1ml于硝酸细菌培养基中，每组接2瓶，其中一瓶立即过滤用以测定原始培养基中亚硝酸根含量，另一瓶置于28温箱培养15天，培养结束，取出三角瓶，培养液进行过滤。
硝化作用强度的测定
一、目的要求
掌握硝化强度的测定方法，了解土壤中氮素如何有效利பைடு நூலகம்及对环境污染的影响。
二、实验材料
样品：新鲜土样
培养基：硝化作用第二阶段培养基
亚硝酸钠1克；硫酸镁0.03克；硫酸锰0.01克
磷酸氢二钾0.75克；碳酸钙3.0克；水1000毫升
格里斯试剂：
1.溶液Ⅰ：称取对氨基苯磺酸0.5g(0.05g)溶于150ml(15ml) 30%醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
四、结果计算
NO2–(mg/30ml)=X(ug/ml)*比色体积*稀释倍数*10-3
X（由标准曲线查知）10-3（换算为ml）
土壤消化强度=原始培养基中NO2–量—培养基中NO2–量
运用气压过程分离法测定旱地苹果园土壤硝化—反硝化作用
运 用 气 压 过 程 分 离 法 测 定 旱 地 苹 果 园 土 壤 硝 化 一 反 硝 化 作 用
葛顺峰 ，姜远茂 ，彭福 田，房祥 吉，陈 汝
（． 山东农业大学作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 １ ２ １１ ；２ ７ ０８ ．山东农业 大学园艺科学与工程学院 ，山东 泰安 ２１１） ７０ ８
（ ． Ｓａ ｅ ａｏａｏｙｏ ｒ ｉ ｏ ｙ ｈ ｎ ｏ ｇ Ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎ ｅ ｉ ，Ｔ ｉ ７ ０ ８ Ｓ ａ ｄ ｎ ， ｈｎ ； １ ｔｔ Ｋ ｙ Ｌ ｂ ｒｔ ｆ ｏ Ｂ ｏ ｇ ，Ｓ ａ ｄ ｎ ｇ ｃ ｌ ａ Ｕ ｉ ｒ ｔ ａ￣ ２ １ １ ， ｈ ｎ ｏ ｇ Ｃ ｉａ ｅ ｒ Ｃ ｐ ｌ ｉ ｕ ｖ ｓｙ ｍ
料 和 根 际效 应 也 避 免 土柱 发 生 紧 实 作用 ；土 柱 取样 量 以 每 个 处 理 ３个 环 刀 ，重 复 ３次 较 好 ；苹 果 园 土壤 总 硝
化速率和反硝化速率年周期变化动态呈先升高后降低的趋势 。 关键词 ：气压过程分离法 ；硝化一反硝化作用 ；环 刀土样 ；旱地苹果 园 中图分类号 ：Ｓ６ １ ６ ．１ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ ２２ （００ ３— ３ ０— ４ ００— ３ ４ ２ １ ）０ ０ ３ ０
２ Ｃｌ ｇ ｆ ｏ ｉ ｌ ｒ ｃｅｃ ｎ ｎｉ ｅｉ ， ｈｎ ｏｇＡ ｒｕｔｒｌ ｎｖｒｔ， ａａ ７０ ８， ｈｎ ｏｇ ｈｎ ） ． ｏｌ ｅｏ ｒｃ ｔ ｅＳｉ ｅａｄｅｇｎ ｒ ｇ Ｓ ａｄｎ ｇｉ ｌ ａ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｔ ｉｎ２ １１ Ｓ ａｄｎ ，Ｃ ｉａ ｅ Ｈ ｔｕｕ ｎ ｅ ｎ ｃ ｕ ｅｉ
Ａｂｓｒ ｃ ： Ｎｉｒｆ ａｉｎ ａ ｄ ｄ ｎ ｔｉ ｃ ｔ ｎ ｗｅ ｅ ｄ ｔ ｒ ｎ ｄ ｕ ｉｇ ｔ ｅ Ｂａ ｏ ｔｉ ｏ ｅ ｓＳ ｐ ｒｔｏ ｅ ｈ ｉ ｕ ｉ ｔａ ｔ ｔ ｉ ｔｏ ｎ ｅ ｉ ｆ ａｉ ｒ ｅｅ ｍｉ ｅ ｓｎ ｈ ｒ ｍｅ ｒｃＰｒｃ ｓ ｅ ａ ａｉｎ ｔｃ ｎ ｑ ｅ ｎ ｉ ｃ ｒｉ ｏ ｕ ｌｎ ｐ ｌ ｒ ｈ ｒ ｐ ａ ｄ ａ ｐｅ ｏ ｃ ａ ｄ，ａ ｄ ｉ ｔｏ ｕ ｅ ｈ ａ ｉ ｒｎ ｉ ｌ ｓ ａ ｄ ｄ ｔｒ ｉａｉ ｎ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｈ ｅ ｍｅｈ ｄ，ａ ｄ ｎ ｎ ｒ ｄ ｃ ｓ ｔ ｅ ｂ ｓｃ ｐ ｃｐ ｅ ｎ ｅｅ ｎ ｔ ｔ ｏ ｆ ｔｅ ｎ ｗ ｔ ｏ ｉ ｍ ｏ ｎ ｄ ｓ ｕ ｓ ｓ ｓ ｍｅ ａ ｐ ｃｓ ｉ ｐ ｌ ａｉｎ ｏ ｓ ｍｅｈ ｄ ｎ ｕｐａ ｄ ａ ｐ ｅ ｏ ｃ ａ ｄ． ｉｃ ｓ ｅ ｏ ｓ ｅ ｔ ｎ ａ ｐ ｉ ｔｏ ｆｔ ｔｏ ｏ ｌ ｎ ｐ ｌ ｒｈ ｒ ｃ ｈｉ Ｔｈ ｅ ｕｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｅｒｓ ｌ ｓｏ ｄｔａ ： Ｔ ｅ ｓ ｈ
土壤硝态氮铵态氮的测定(精)
（二）土壤硝态氮的测定1、酚二磺酸比色法1）方法原理土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。
酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。
2）主要仪器分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂（1）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。
使用时须注意其强烈的腐蚀性。
如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。
试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N 溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。
（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、（4）CaCO3（分析纯、粉状）、（5）1:1 NH4OH、（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤（1）浸提：称取新鲜土样（注1）50g（风干土样25g）放在500mL三角瓶中，加入CaSO4•2H2O 0.5g（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]和250.00mL蒸馏水，盖塞后，用振荡机振荡10min。
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实验二十三
硝化作用强度的测定
硝化作用强度的测定
◆目的要求
◆实验材料
◆试验程序
◆土壤硝化作用强度
◆思考题
目的要求
掌握硝化作用强度的测定方法，从而使学生进一步了解土壤中氮素如何有效利用及对环境污染的影响。
◆样品：新鲜土壤。
◆培养基：硝化作用第二阶段用培养基，
药品用分析纯。
配方如下：
NaNO2 1g
MgSO4·7H2O 0.03g
MnSO4·4H2O 0.01g K2HPO40.75g NaCO3(无水）1g NaH2PO40.25g CaCO3 3.0g 蒸馏水1000mL
◆格利斯试剂：
1. 溶液Ⅰ 称取对氨基苯磺酸0.5g,溶于150ml30%醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
2.溶液Ⅱ 称取α－萘胺0.5g,加入50mL
蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150mL,保存于棕色瓶中。
◆亚硝酸银标准液称取1.5000g分析纯亚硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入1000mL容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀。
用时以此液稀释成标准液（每mL含0.01mg的NO2-)
其它：
容量瓶（50mL、100mL、1000mL）、移液管（1mL、5mL）、三角瓶、漏斗、滤纸、玻棒、洗瓶等及分光光度计。
实验程序
◆培养基的配制及1/10土壤悬液的制备
◆接种培养
◆用比色法测定虑液中的亚硝酸银含量
实验程序1 (培养基的配制及1/10土壤悬液的制备)
◆在150mL三角瓶中装30mL硝酸细
菌培养基(要准确称量),灭菌,每组2
只.
◆在150mL三角瓶中装45mL蒸馏水,
并放入少许玻璃珠灭菌,每组1只.
◆1/10土壤悬液的制备称5g土壤
放入装有45mL带玻璃珠的三角瓶
中,振摇5min。
（接种培养）
◆吸取1/10土壤悬液1mL接种到硝酸细菌培养基中，每组接2只三角瓶过滤立即用以测定原始培养液中亚硝酸根含量，另一支三角瓶置于280C 温室中培养15d.
◆培养结束，取出三角瓶，培养液进行过滤。
(用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量）
◆取滤液1mL于50mL容量瓶中，稀释至约40mL，加入1mL格利斯试剂Ⅰ，放置
10min。
再加入1mL格利斯试剂Ⅱ和
1mL2%醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度，放置10min后，用分光光度计（波长
520nm)比色测定。
◆亚硝酸银标准曲线的绘制吸取压硝酸银标准液0、1、2、3、4、5mL，分别放
入50mL容量瓶中，定容。
与待测样品同样条件进行比色，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
实验程序3 (用比色法测定滤液中的亚硝酸根含量）
结果计算
NO2-(mg/30mL)=X(m g/mL) ×比色体积×稀
释倍数×10－3
式中X(m g/mL）——由标准曲线查知
10－3——换算为mg
土壤硝化作用强度 计算公式：
硝化作用强度＝原始培养基中NO 2-量－培养基中NO 2-量原始培养基中NO 2-量
×100％
思考题
◆什么叫硝化作用？硝化作用由哪两类细菌参与？
◆根据硝酸细菌培养基的组成成分，硝酸细菌属何种营养类型？
◆本实验的原理是什么？
◆实验中要注意什么？
实验二十三结束。