激光诱导荧光_LIF_技术在生物学领域中的应用与发展_高雪松

激光诱导荧光!!"#"技术在生物学领域中的应用与发展高雪松余小敏!!"北京理工大学信息科学技术学院#北京!#$$%$$&"亚洲光学集团!杭州"科技开发有限公司#杭州’!$$$%"%摘要&概述了激光诱导荧光!()*"技术在生物学中的应用及其进展’给出了()*技术分类及其应用领域#并介绍了()*技术在探测化学毒气和生物战剂方面的应用以及各国对生物战剂的防护手段’关键词(激光诱导荧光$生物医学应用$化学毒气$生物战剂$探测中图分类号(+,’())*+",#+-./-01,/234.56"257*6-32/"2."281479+.:+-*-;<,.54#/=2>2*-)?2.#!"#$%&’()*+,-$./)’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引言荧光是物质的一种光致发光现象#荧光光谱对应物质的下能级结构’利用分子荧光作为信息载体进行物质分析和检测的研究方法称为荧光分析法!荧光诊断法"’激光诱导荧光!K/(&53*L%8&L S<%)! 5&(8&*8&#K3S"技术是荧光诊断法的一种#与普通荧光诊断方法不同的是K3S激发光源是可以精确控制激发光参数的激光’最早记录荧光现象的是西班牙的Y)*/5L&(Z# [\]\年他在一种木头切片的水溶液中发现了天蓝色的光#此后在相关媒体上陆续出现有关荧光研究的报道#但在解释发光机理方面却没有进展’直到[E\G年#76)W&(对荧光现象进行了科学的解释之后#对荧光现象的研究才普遍开展起来#并使之成为物质检测和分析的一种有效手段!进入!"世纪"科学仪器的发展加速了荧光技术的发展与应用"光电倍增管#光谱仪#像增强器###$技术#计算机和激光的发明和使用给荧光分析技术带来了一个新的飞跃!./0,技术的分类荧光分析是对物质分子的激发光谱和物质荧光光谱参数的分析!激发光谱是指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率"而荧光光谱是指某一激发波长引起物质发射不同波长荧光的相对强度"它们均是用荧光分析法进行定量和定性分析的基本参数和依据!荧光分析方法有荧光光谱分析#同步扫描荧光光谱分析#三维荧光光谱技术#时间分辨荧光探测#荧光偏振测定和荧光成像等!荧光光谱分析研究的是荧光光谱形状#荧光强度#峰值位置#峰值带宽#与特征波长对应的荧光强度等相关信息"称为常规荧光分析技术!同步扫描荧光光谱分析技术是在同时扫描激发波长和荧光波长情况下获得的"由测得的荧光强度信号与对应的激发波长构成荧光光谱图"称为同步荧光光谱!该方法的优点是使光谱简化#谱带窄化#减小光谱重叠现象和降低散射光影响!三维荧光光谱技术测量的是物质荧光强度随激发波长变化关系的图谱"即三维荧光光谱!这种技术的优点在于它能获得激发波长与荧光波长同时变化的荧光强度信息!时间分辨荧光探测技术是指利用荧光的时间特性来提高物质鉴别的选择性!物质分子不同"荧光寿命也不相同"因而可以利用寿命的不同来区分化合物!利用一个脉冲激发光源和具有时间$窗%的门检测系统"可以得到在固定波长的荧光强度与时间的关系曲线和在固定时间的荧光发射光谱!该方法的优点是能够对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨并分别测定"消除杂质与背景荧光干扰"提高信噪比"有助于对生物大分子和基团作用的研究!荧光偏振测定是通过测量荧光偏振方向的变化来鉴别物质!受激光激发的物质产生的荧光也是偏振的"荧光偏振方向与荧光物质的体积#形态和所处理的环境有关"因此荧光偏振方向反映物质变化信息!该方法已广泛应用于免疫检测和生化研究领域!荧光成像是指利用凝视型或扫描型成像器件对被研究物质的荧光图像进行探测的方法!该方法与图像融合技术结合"可同时提供目标的荧光光谱信息和位置信息"其突出优点是直观#便于定位!1/0,技术的应用领域由于激光荧光诊断技术具有高效#痕量#微观#准确#灵敏#非接触#光学选择性强#精度高#实时性强#可非接触测量和特异性等特点"因此在以下方面得到了广泛应用&%&用于医学诊断’’&在生物化学和分子生物学中的应用"如脂肪族#芳族等化合物荧光分析’氨基酸#蛋白质#维生素#胺类化合物#酶和铺酶等的荧光分析’(&用于无机化合物的荧光分析"如微量元素检测等’)&用于分析地矿中各种元素的含量’*&用于日用清洁剂#化妆品卫生指标的检测和生产过程中的在线监控’+&用于测定大气污染类型#程度’污染物成分和含量’测定江河湖海和土壤中的污染成分’,&用于药物#毒物#农药和毒品的鉴定和探测"利用遥感和光纤技术可伸展作用距离’-&用于食品卫生检验’.&用于探测燃烧和爆炸温度’/&用于对兴奋剂等违禁药品的检测!2/0,技术在生物医学中的典型应用激光诱导荧光技术最早是作为一种激光诊断技术在生物医学中得到应用!一般来说"激光诊断技术图!香农的信息传输模型是指用激光作光源!通过研究被测物质与激光相互作用过程中所发出的信息来获得被研究物质的结构"组分等固有组成的一种获得信息的方法#如图!所示!根据香农的信息传输模型!任何对象都向外界发出信息来表明其固有特性!即有对外界的表象!这些表象可以通过不同途径被探知!通过对表象的了解加之科学的分析研究!可以得到对象的固有特性$激光诊断技术的作用是通过激光的引入!使信源发出信息的编码%信道"噪声和译码过程发生改变!其目的是提高可被探测信号的信噪比!并且上述改变过程是以信宿能获得最大信息量为原则$因此基本的激光诊断系统是采用激光技术"电子学技术和计算机技术的综合系统$在这个系统中!所用的光学方法是核心!电子学是信息处理的基础!而计算机和电子技术是手段$激光诱导荧光技术在生物医学中较为成熟的应用有如下几个方面$($)癌症早期诊断"#世纪初!人们已经发现人体正常组织和恶性肿瘤组织的荧光光谱存在很大差异$最早发现肿瘤组织和正常组织存在荧光差异的是$%&’()*+!!,"-年他在肉瘤实验模型中观察到肿瘤组织在紫光照射下能发出红色荧光$./0*%和1/*2)3在!,44年发现!当把手术切除的乳腺组织暴露在紫外光下时!正常组织发出绿色荧光!而肿瘤组织发出粉红色荧光$ 5/67*和1)38)*于!,-"年发现从血红质中提取出的光敏剂血卟啉&972)0%:%*:;<*’3=9:’易存于肿瘤组织中!并可发出较强的有特征峰的红色激发荧光$ !,>-年?%3(;7@7等人在乳腺癌%皮肤癌和口腔癌的肿瘤组织中也观察到类似现象!至此人们注意到生物组织的内源性自体荧光在肿瘤诊断中的潜在应用价值$!#世纪A#年代初!新的光敏剂血卟啉衍生物&972)0%:%*:;<’3B7*’C)0’C7!9:B’研制成功!与9:相比!9:B有效性强%浓度高!对肿瘤组织可表现出更好的特异性!推动了外源药物荧光诊断的发展$实验结果表明!在支气管肺癌%皮肤癌%宫颈癌和口腔癌等多种部位的肿瘤组织中都可观察到9:B的特殊红色荧光!对肿瘤组织的定位具有明显应用价值$ !,A#年激光的问世以及内窥镜和光纤技术的应用!使人体腔内癌症临床早期诊断!即利用DEF进行癌症早期诊断成为可能$进入"#世纪G#年代中期以来!已经在临床成功地实现了肺癌%胃癌%肠道癌和宫颈癌等早期诊断$激光诱导荧光技术在诊断早期肿瘤方面的应用价值已逐渐引起医学界%工程界专家的关注!并成为激光医学分支学科中的一个热点研究方向$($%免疫细胞活性检验自然杀伤细胞&H)0/*)&I’&&7*!HI’是机体非特异性免疫细胞中的重要成员$HI细胞无需抗原预先激励!也不需要抗体参与!就可以直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞!因此在机体免疫监视%抗肿瘤和早期抗感染免疫过程中起重要作用!建立快速准确新型的!"细胞杀伤活性检测法"对检测非特异性免疫功能#基础医学的研究和临床某些疾病$如肿瘤%的诊断和疗效评价具有重要意义!放射免疫分析法$#$%%具有灵敏度高#专一性强的特点"但同时又具有极强的副作用!非放射性的时间分辨免疫荧光分析法$&’()*#)+,-.)/0-1,2)+!3)43)$((14,5++56"&#0$%%是继放射性核素免疫分析法和荧光免疫分析法之后发展起来的一种新型免疫分析方法"具有无放射性#特异性强#稳定性好#线性范围宽#取样少和分析速度快等优点!用&#0$%测定!"细胞杀伤活性"能克服放射性免疫分析法污染环境和酶释放检测法灵敏度低和特异性较差等缺点!78世纪98年代"芬兰:5--53实验室和加拿大的;6<)2公司分别研制出时间分辨荧光检测仪及其配套试剂$例如=1;%>&和=1?&>%等%"使&#0$%开始进入应用阶段"并在临床和基础医学中迅速推广!&#0$%已经用于淋巴腺激活的杀伤细胞活性检验$@,-A(544)B5-C"DE99%#&淋巴细胞活性检验$F254<)2A2B5-G"DE99%#辅助媒介细胞溶解检验$;1’54/H6+B264"DEE7%和先导淋巴细胞毒性确定IH,1(5 )B5-C"DEEJK"具有灵敏度高#专一性强#稳定性好和非放射性等优点!"5L<-,(<)2A等人用铕标记靶细胞"用&#0$%方法测量!"细胞活性!其基本原理是将镧系稀土离子标记到靶细胞后"将标记的靶细胞溶于免疫细胞溶液"靶细胞被免疫细胞破坏后"释放出镧系稀土离子"被释放稀土离子的数量反映免疫细胞的活性!由于镧系稀土离子的荧光寿命很长$百微秒量级%"远大于生物组织$纳秒量级%"因此镧系螯合物的荧光衰减时间远大于背景荧光的衰减时间!&#0$%利用这一特性"延迟特定时间后"测量样品发出的荧光"避免短寿命背景荧光的影响"节省了传统的荧光剂$羧基荧光剂衍生物%标记检验过程中必需的背景校正步骤!从78世纪E8年代起"我国医疗单位也相继开展了&#0$%的研究和临床工作"已合成多种螯合物#专用试剂"建立了多项&#0$%分析方法"如北京J8D医院用&#0$%进行了肿瘤标记#蛋白质激素#流体类化合物和MH@标记物的检测"上海儿童医院用&#0$%测定了妊娠NODN周妇女的血清甲胎蛋白及新生儿的促甲状腺素等"但截止目前国内尚未见&#0$%用于!"细胞杀伤活性检测的报道!&#0$%检测法可应用于如下几个方面&$D%快速准确判断机体非特异性抗肿瘤#抗感染能力’$7%在以提高机体免疫系统活性的临床药物$例如中药%治疗肿瘤过程中"及时获得治疗效果信息’$J%为抗肿瘤药物的研制和生产提供免疫学依据’$P%有望成为人体血液常规检验的一项内容"以便对!"细胞活性低下者及时提出治疗方案!1$2化学毒气和生物战剂的探测生物战剂是一类由活的有机体产生的高活性特殊毒素!目前世界上大约有78个国家已被证实或怀疑拥有化学武器计划"有的国家还有生物战计划!对生化战剂的防护是各国国防体系中的一个重要组成部分!随着基因工程和其他生物技术的发展"许多毒素的大量生产变得比较容易!虽然它目前还不能被做成大规模的毁伤性武器"但是与核武器相比"其生产和使用要容易许多"生化武器已对社会和地区稳定以及世界和平构成了严重威胁!对生化战剂的及时侦察和探测在战略和战术上都有极其重要的意义"有必要加强对它的研究和防护!在这个方面"美国正向着生化并检#远程遥测#即时报警和自动报告的方向发展!目前用于生化战剂侦检的方法有许多种"其中点探测方法有特种酶探测法#离子迁移分光光度法#火焰分光光度法#表面声波法#固定化酶法#气相色谱与离子迁移法#生物光度法和压电法等’用于远距离遥感的有传输型和功能型光纤探测法以及Q$0探测法!由于Q$0探测法适于现场#实时#遥感探测的特点!因此世界各国普遍采用这种方法进行生化战剂的遥感"对生物战剂的研究包括两个方面!一是对战剂的分析!包括种类#来源#毒性和理化性质的分析$二是防护手段的研究!包括生物战剂的实时监测#报警#个人防护#区域防护#诊断#预防和治疗等方面的研究"根据对战剂的分析!在!""#年底举行的国际禁止化学武器会议上列出了近$%%种毒素!其中有&%%’(%%种毒素因为生产规模#施放面积#毒性#稳定性等方面的限制!在短期内尚不能构成军事威胁"但研究表明!有几种毒素!不仅具有极高的毒性%仅几公斤或几十公斤就可以构成)%%平方公里内的人员伤害&!而且能够大批量生产%几吨至几十吨&!可能用于生物战剂"有些毒剂虽然不能大量生产!理化性质不甚稳定!但也可能成为恐怖组织在特定场合实施攻击的武器"在防护手段研究方面!各国对生物武器防护研究的重要性和迫切性的认识日益提高"美国在*""+财年’国防报告(中提出由国防部向国会提交核生化防护年度报告!这表明生物战剂的防护已经与核武器和化学武器防护一起在美国国防中占有特殊重要的地位"各国对生物战剂侦检报警系统研制均高度重视!其中战场区域性早期预警系统的研制倍受重视"法国,-.研究机构研究的装在空运掩蔽部内的生物战剂一体化侦检系统!已于/%%+年投入部队使用"加拿大萨菲尔德防护研究所研制的,0.123!型侦检系统利用紫外激光照射测定粒子的荧光量及光谱!以确定粒子是否来源于生物战剂"该系统能分辨+种含生物战剂粒子!分辨时间不超过#4"美国能源部564178964国家研究所研制的:"$型远程生物遥感侦检系统!战术应用距离为+;9!战略应用达*<;9!系统可机载#舰载或装载于地面平台"=>?@AB@;公司研制的短程生物遥感侦检系统%3CD.323&的侦检距离为+;9!该系统用二极管泵浦EFGH1I激光器三倍频后的紫外激光%(++J9&作为激光雷达生物战剂侦检器的泵浦源!系统接收生物战剂受激产生的荧光%(<<’$<<J9!该荧光为存在于所有生物材料中的色氨酸所特有的&达到侦检目的"!结束语激光诱导荧光技术在生物医学中的应用范围正不断扩大和深入开展!目前已经取得了丰硕成果!并有一部分成果转化为商品!随着激光技术#探测技术和电子技术等关键技术水平的不断提高!激光诱导荧光技术将在生物医学的各个领域中发挥更大的作用"%参考文献略&%E6KLM。