常规电镜操作流程

常规电镜操作流程

以Spirit 120为例

1.电镜的日常维护

1.1如何加液氮

每天第一位使用的电镜的用户首先要检查电镜各项真空值是否正常，若正常可给电镜冷阱加注满液氮再观察使用。保持冷阱液氮液位的目的有二：（1）防止样品污染，（2）维持样品室真空度正常。

具体操作方法如下：将冷阱竖放置桌面上，向冷阱中倒入半罐液氮，待液氮表面平稳后，再将冷阱转移至电镜铜导线位置处，缓慢将铜导线放到冷阱中后放稳冷阱。完成以上步骤后再将冷阱中加满液氮，盖好盖子，冷却15分钟后再开始使用电镜。

1.2如何升/降高压

每日首位（最后一位）使用电镜的用户，需要给电镜升（降）高压，具体操作步骤如下：

（1）升高压（Sprit 120电镜为例）

在Workset_Setup界面中找到High Tension以及Filament两项。下拉菜单选中40 kV后，再点亮High Tension按钮（颜色由灰色变为黄色），观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，点击High Tension下拉菜单旁边向右按钮，高压值由40 kV 增至60 kV，再次观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点击High Tension下拉菜单旁边向右按钮增加高

压值，如此几次直至高压升至100 kV。

高压升至100 kV后，勾上High Tension界面最下端的Free high tension一项，更改升高压的步长为3 kV后，点击这一栏中向右按钮将高压升至103 kV，观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点向右按钮将高压升至106 kV，如此几次直至高压升至115 kV。

高压升至115 kV后，再将每次加高压步长缩小至1 kV，点击向右按钮缓慢将高压升至120 kV。注意：每改变一次高压值均要等电流稳定后再继续升高压。电压升至120 kV后勾掉Free high tension这项。

（2）降高压（Sprit 120电镜为例）

在Workset_Setup界面中找到High Tension以及Filament两项。点击下拉菜单旁边向左按钮，将电镜高压由120 kV降至100 kV，观察Filament中Emission电流变化情况，待电流值基本不变后，再点击下拉菜单旁边向左按钮继续降电镜高压。高压降至20 kV后，点High Tension按钮（由黄色变为灰色），关闭电镜高压。

1.3如何做Cryo-cycle

每天最后一位使用完电镜的用户，需要给电镜做Cryo-cycle，主要目的是维持电镜良好的真空状态。

Cryo-cycle的具体操作步骤如下：（1）首先要检查物镜光阑是否退出、样品台是否归零、放大倍数是否降至是几十倍、光斑是否扩至最大。（2）保证以上步骤完成后，先关column，再关灯丝电流，再逐级降高压至20KV后再关掉High tension。（3）扶稳冷阱，缓慢将冷阱从电镜上转移至桌面，注意不要碰到铜导线。将多余的液氮倒回保温瓶中备用，冷阱放回制定位置平放保存。（4）点击Cryo-cycle，待出现倒计时且进行1分钟后再刷卡下机。

2.常温样品观察

2.1上样前准备

检查电镜真空状态，样品台是否归零，检查冷阱液氮液位。

2.2上样品

未通过中级以上考核用户需由已通过考核的陪同人上样。

2.3加灯丝电流

待Column真空值降到15以下后，点击Filament，按钮变为黄色即为开启状态。

2.4开Column

Column按钮灰色时为开启状态。

2.5低倍浏览样品大致情况

关灯后拿掉盖在电镜荧光屏上的黑色橡胶盖，调节电镜放大倍数至几百倍后移动样品台，快速浏览样品染色情况。点击Workset _search中的add，添加感兴趣区域到search界面。

2.6调整Z轴高度

几百倍下找到样品中的一个标志点（如脏东西），移动样品台使标志点处于荧光屏的正中心。顺时针旋转Magnification旋钮，调节电镜放大倍数至2000X至3000X，微缩光斑（逆时针旋转intensity）至充满荧光屏状态。点击Workset_stage界面右上方的小三角，打开隐藏界面，切换至control界面。点击control界面中的set alpha（变为黄色），使样品台倾转-15°，此时原处于荧光屏正中的标志物会偏移出中心位置，按右侧控制面板最右侧的Z axis的上键或下键，使标志物重回荧光屏的中心。再次点击set alpha（颜色由黄变灰），使样品台恢复为0°。

2.7插入侧插相机

顺时针旋转Magnification旋钮，调节电镜放大倍数至希望拍照倍数，同时逆时针旋转intensity按钮，缩拢光斑至满屏状态。荧光屏上盖上黑色橡胶盖，点击放在桌上的侧插相机控制手柄的绿色插入控制键（in），插入侧插相机。侧插相机控制界面选中live模式，移动样品台寻找合适的拍照位置。

2.8聚焦

打开侧插相机的傅里叶变换（Fourier Transform）窗口，旋转右侧控制面板focus旋钮（focus下旋钮控制每次调节的步长，上旋钮控制物镜电流），结合图像和FFT环的变化情况，找到正焦点。正焦时，图像颗粒边界模糊，FFT界面亮度均匀看不到环。欠焦时，图像颗粒边界为白色。过焦时，图像颗粒边界为黑色。找到正焦点后，点击下右侧控制面板的R2键重置defocus值为零，在此基础上调节focus旋钮至欠焦-3 μm左右观察样品（注：不同放大倍数下欠焦值设定不同，倍数越低，欠焦越大。50KX左右时，欠焦值调至-3

μm为宜）。

2.9拍照

找到合适区域点击侧插相机控制界面的Snapshot拍照。

2.10保存照片

点开侧插相机菜单栏中Acquisition settings项（形如DV）设置照片存储路径（Saving）和照片名称（Document Name_Snapshot）。

2.11下样前准备

点掉侧插相机的live关闭相机，点击放在桌上的侧插相机红色退出控制键（out），撤出侧插相机。逆时针旋转Magnification旋钮，降低放大倍数至几十倍，同时顺时针旋转intensity扩大光斑至最大。若使用了物镜光阑需退出。荧光屏上重新盖好黑色橡胶盖子。点击Workset界面stage_control中的holder项，使样品台归零。点击setup中的Column（变为黄色），关闭镜筒。点击Filament（变为灰色），关闭灯丝电流。Emission值为0后表示已经关闭。

2.12下样

未通过中级以上考核用户需由已通过考核的陪同人下样。

2.13刷卡下机并做实验记录登记

3.冷冻样品观察（需要使用底插相机）

3.1上样前准备

检查电镜真空状态，样品台是否归零，检查冷阱液氮液位。

3.2领取Gatan626杆

通过高级考核的用户可以自己领取，未通过该项考核的用户需由该仪器管理员或已通过高级考核的用户陪同领取。

具体领取方法如下：到冷冻样品杆存放处领取Gatan626杆并登记，同时拉开shutter检查一下压样品的卡环是否在。如果不在，请及时与管理员联系。

3.3常温下检查Gatan626杆的密封性

首先修改Workset_Stage_Control界面中的set alpha角度为-55°，然后点击set alpha（由灰色变为黄色），使样品台倾转-55°，插入样品杆，等待预抽。预抽结束后，旋转样品杆至球阀开放后将样品杆完全送入镜筒内。再次点击set alpha（由黄色变为灰色），使样品台恢复为0°（未通过高级考核用户需由已通过考核的陪同人上样）。插入样品杆后观察电镜真空的变化，若起伏不大，则说明此杆可以使用；反之，则需要更换样品杆。

3.4冷杆

向workstation和样品杆的杜瓦罐中同时加入液氮，初加入液氮时拉动下shutter（shutter打开一半即可，防止卡环被液氮冲走），防止冷却过程中shutter冻住。workstation和杜瓦罐中的液氮大沸腾后（此时说明温度已接近液氮温度），向workstation和杜瓦罐中补充液氮，稍低于workstation中黑色密封层即可。等待workstation和杜瓦罐完全冷却，此过程大约需要15分钟，等待过程中需不断给它们补充液氮，杜瓦罐加满后15分钟内无需再加。

3.5上样

未通过高级考核用户需由已通过考核的陪同人上样。此部分为高级培训内容，略。

3.6加灯丝电流

待Column真空值降到15以下后点击Filament，按钮变为黄色即为开启状态。（T20电镜上下样无需关闭灯丝电流。）

3.7开Column

Column按钮灰色时为开启状态。

3.8低倍浏览样品大致情况

拉开样品杆的shutter。关灯后拿掉盖在电镜荧光屏上的黑色橡胶盖，调节电镜放大倍数至几百倍后移动样品台，快速浏览样品冰层情况。点击search中的add，添加具有代表性的厚度冰层区域到search界面，同时添加一个碳膜破损的位置。

3.9打开Low Dose Mode

切换Workset至Low Dose界面，点击打开的Low Dose（黄色为开启状态）模式。

3.10设定Search倍数

Search按钮为黄色开启态时，电镜系统会默认进入Search所设定的放大倍数、spot size和intensity状态。通常定义search的倍数为能大致看到一个square范围的倍数，如2900X左右，此倍数下的光斑（剂量）不易太小，充满整个荧光屏为宜，以免损伤样品。电镜系统仅能记录当前状态。

3.11设定Exposure倍数与剂量

Exposure的倍数与样品分子量、尺寸以及期望达到分辨率相关，通常为50KX到80KX左右。移动样品台至记录的空位置（search 界面中选中空位置的编号，点击GO，样品台即会自动移动到该为位置。样品台移动过程中Go按钮变灰为不可点状态，移动到指定位置后Go按钮又可以点击。），旋转intensity旋钮至光斑充满荧光屏状态，点开Low Dose界面右侧的三角形图标，展开隐藏界面并切换至Options界面。勾选该界面最下方的continuously，点击Measurement，测试当前光强下的电子剂量。通常情况下，200 kV时，设置剂量为30e/?2/s；120 kV时，设置剂量为15e/?2/s；100 kV时，设置剂量为10e/?2/s；电子剂量与曝光时间相乘即为每张照片所承受的总剂量。若光斑满屏条件下达不到相应的剂量值，可调整Spot Size（Spot Size数字越小，光斑尺寸越大）值以满足需求。切记不要光斑过小，以免损伤荧光屏和样品。

3.12调整Z轴高度

切换至Search倍数，调整Z轴高度，具体调整方法参考2.6步。

3.13调整Exposure倍数欠焦值

Exposure倍数下移动样品台至碳膜区域，点开workset_camera界面中的Live FFT，旋转右侧控制面板上的focus旋钮，对碳膜区域进行聚焦。通常情况下，focus一直沿一个方向旋转时，FFT界面中的圆环数量增加尺寸减少；反方向旋转后，圆环数量不断减少尺寸增大；过了某一个点后，圆环数量变多尺寸减少。该点就为正焦点（FFT中看不到环且各处亮度均匀），找到此点后，点击右侧控制面板上的R2钮，重置此时的defocus值为零。再在此基础上调节defocus值至-3~-5 μm范围内，用于Exposure倍数下的拍照。

初学者可寻找带有冰污染的区域练习调焦。冰边缘出现白色边界时为欠焦，轮廓不清晰时为正焦，边缘出现黑色边界时为过焦。Exposure倍数调好焦后，切换电镜放大倍数至search倍数，调节此倍数下的defocus值至-50~-100 μm范围内，以便观察到square中的孔。

3.14对中Search和Exposure拍照中心点

Exposure倍数下找到一个标志物，如冰渣，点击DM软件或TIA软件中画直线图标，沿图像观察界面对角画两条相交线，交点即为中心。移动样品台，使标志物移至中心位置。切换至Search倍数，观察标志物是否处于中心位置，若不在，点击Low dose右侧小三角，勾选上Options中的Search shift，通过左右控制面板中的Multifunction X/Y调节标志物至中心位置，调节完成后勾掉Search shift。再切换至Exposure倍数观察标志物是否中心，若不在则重复以上步骤。如此反复几次直至Search与Exposure倍数下标志物均处于中

心位置即可。

3.15选择合适区域拍照

找到合适区域点击底插相机控制界面（CCD/TV Camera）的Acquire拍照。

3.16数据存储与格式转化

鼠标右键点击拍摄好的图像，选择Export Data设置图像输出的格式和路径，切记不要将照片存储在桌面或者C盘。点击TIA（TEM User Interface）软件中带绿色A的磁盘标志，可设置自动保存路径和照片名。注意此方式保存的照片为.emi格式，需要后期格式转换。最小化Workset后，最大化TIA软件，展开软件右侧的Folder Export界面，在setting中设置输入、输出路径以及需要转换的格式，全部设置完成后点Export，软件会自动开始转换格式（电脑设备陈旧，切记不要攒太多照片再保存，以免软件瘫痪）。

3.17下样前准备

关闭Low dose，逆时针旋转Magnification旋钮，降低放大倍数至几十倍，同时顺时针旋转intensity扩大光斑至最大。若使用了物镜光阑需退出。荧光屏上重新盖好黑色橡胶盖子。点击Workset界面stage_control中的holder项，使样品台归零。点击setup中的Colum （变为黄色），关闭镜筒。点击Filament（变为灰色），关闭灯丝电流。Emission值为0后表示已经关闭。

3.18下样及样品回收

未通过高级考核用户需由已通过考核的陪同人下样。

3.19刷机下机并做实验记录登记

4.电镜常规合轴

4.1调整Z轴高度

2000X至3000X左右倍数进行，具体调节方式见2.6步。

4.1对中聚光镜光阑

逆时针或顺时针旋转intensity旋钮，查看光斑是否同心收拢或发散，若没有同心收拢或发散，则说明聚光镜光阑没有对中。调节方式如下：逆时针旋转intensity聚拢光斑至最小，滚动左侧控制面板上的trackball移动光斑至荧光屏中心，顺时针旋转intensity扩大光斑与荧光屏上的圆圈相交，微调节聚光镜光阑X/Y方向旋钮，使光斑与荧光屏上的圆圈重合。再次查看光斑是否同心收拢或发散，若同心则表示已对中。

4.2聚光镜消像散

若扩大或收拢光斑时，光斑不圆或为椭圆形，则表示存在聚光镜像散。消除聚光镜像散的方式如下：Workset-Stigmator中选中

Condensor（变为黄色），通过左右控制面板中的Multifunction X/Y调圆光斑，调节完成后点None（变为黄色），系统会记录调整结果。调节时可以以荧光屏上的圆圈为参考系。

4.3调整Rotation center

2000X至3000X左右倍数下微聚拢光斑，选中Workset-Direct Alignment的Beam tilt PP X，用左右两侧控制面板上的Multifunction X/Y将荧光屏上（两个）跳到的光斑调至不动，调节完成后点Done。再切换至Beam tilt PP Y，同样用左右两侧控制面板上的Multifunction X/Y将荧光屏上（两个）跳到的光斑调至不动，调节完成后点Done。调节完成后检查光斑是否处于荧光屏正中，若不在则选中Workset-Direct Alignment的Beam shift，通过左右控制面板中的Multifunction X/Y将荧光屏上的光斑调至正中，调节完成后点Done。扩散光斑至充满荧光屏状态，以便后续操作。上述调节完成后，选中Rotation Center，通过左右控制面板中的Multifunction X/Y将荧光屏上的光斑调整成原地抖动状态；或光斑扩大情况下，中心像抖动最小，调节完成后点Done。进行此步调节前，可将标志物移至荧光屏中央以便观察调节。

顺时针旋转Magnification旋钮，调节放大倍数至50KX或希望拍照的更高倍数，聚拢光斑以便观察。在此倍数下重复上述步骤。

4.4物镜消像散

插入侧插相机，打开侧插相机的傅里叶变化（Fourier Transform）窗口，旋转右侧控制面板focus上旋钮，将图像调至略微欠焦状态。观察此时FFT环是否圆，若不圆，则说明存在物镜像散。物镜像散调节方法如下：打开Workset—Stigmator，点击Objective（变为黄色），调节左右控制面板中的Multifunction X/Y，将FFT环调圆，调节完成后点None。调节过程中可改变每次调节步长（Step size），

数值越大调节速度越快。为避免像散越调越大，可将当前像散值（Stigmator三列中某列可点的数字）赋值给其他两列中的一列。像散过大时，可选中被赋值的一列，像散即恢复调前状态。

5.物镜光阑的插入方法

插入物镜光阑的目的是挡住高角度散射电子，以提高质厚衬度。是否插入物镜光阑以图像清晰与否为准，不做强制要求。物镜光阑插入方法如下：图像聚好焦后，退出相机，插入小屏（荧光屏左侧控制杆）以避免透射束过强损伤荧光屏，点击右侧控制面板Diffraction，进入衍射模式。此时，可观察到透射束落在小屏上，旋转focus旋钮，聚拢透射斑至最小，插入物镜光阑，微调节物镜光阑X/Y方向旋钮，保证光阑中心与透射束中心重合。调节完成后，点击Diffraction，退出衍射模式，抬起小屏，扩散光斑至充满荧光屏状态，以便后续操作。下样时，退出物镜光阑。

6.实验记录登记

完成实验刷卡下机后，请如实填写实验记录，写清个人信息以及陪同人姓名。实验台整理干净后离开。