乙酰胆碱酯酶活性测定
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
酶动力学实验报告
酶动力学实验报告酶动力学实验是一项旨在研究酶的活性与反应速率之间关系的实验。
本次实验旨在通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，进一步了解酶的催化作用和动力学特性。
实验采用乙酰胆碱酯酶（AChE）为模型酶，选择丙酮胆碱作为底物。
1. 实验目的本实验旨在探究酶动力学的基本原理，并通过测定不同底物浓度对酶反应速率的影响，建立酶底物反应速率的动力学方程。
2. 实验原理乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种具有催化分解乙酰胆碱能力的酶。
实验中，我们将通过测定乙酰胆碱被AChE分解产生的胆碱的量，来间接测定酶反应速率。
3. 实验步骤3.1 制备实验溶液依次向一组试管中加入0.5 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液、0.1 ml AChE溶液、0.1 ml不同浓度的丙酮胆碱底物溶液，并用蒸馏水稀释至1 ml。
3.2 酶反应体系的建立将制备好的试管放入恒温水浴中，并将温度维持在37°C恒温条件下。
在反应开始前，将所有试管放在水浴中预热5分钟，确保反应体系温度均匀。
3.3 反应开始在预热后的试管中，迅速注射0.1 ml乙酰胆碱底物溶液，并用计时器计时，开始测量反应时间。
3.4 反应停止在不同反应时间点，取出等体积试管放入冷水中，停止酶反应。
不同试管的停止时间需控制在一定时间范围内。
3.5 测定胆碱产量将反应停止后的试管转移至离心机中，以10000 r/min的速度离心5分钟，离心后取出上清液，用比色皿测定胆碱的含量。
4. 数据处理与分析4.1 曲线拟合根据测得的胆碱产量数据，绘制初始速率随底物浓度变化的曲线。
采用非线性拟合方法，拟合酶底物反应速率的动力学方程。
4.2 动力学方程分析拟合出的动力学方程，推导出酶底物反应速率的相关参数，如最大速率（Vmax）和底物浓度为一半时的速率（V0.5）等。
4.3 酶动力学分析通过分析动力学参数，了解酶的催化活性和抑制效果等信息，进一步研究酶的机制和性能。
5. 结果与讨论根据实验数据，绘制了初始速率与底物浓度的曲线。
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的检测与临床应用
在神经系统疾病治疗过程中，检测乙酰胆碱酯酶的活性可以评估患者的病情状 态，为调整治疗方案提供依据。
评估治疗效果
评估肾脏治疗效果
通过比较治疗前后血液中乙酰胆碱酯酶的活性变化，可以评估肾脏疾病的治疗效果，有助于指导后续 治疗。
评估神经系统疾病治疗效果
检测乙酰胆碱酯酶的活性可以评估神经系统疾病的治疗效果，为患者预后判断提供参考。
应用
诊断疾病
诊断肾脏疾病
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的活性 变化可以作为肾脏疾病的辅助诊断指 标，有助于早期发现肾脏损伤。
诊断神经系统疾病
乙酰胆碱酯酶在神经系统中有重要功 能，检测血液中乙酰胆碱酯酶的活性 可以辅助诊断神经系统疾病，如阿尔 茨海默病、帕金森病等。
监测病情
监测肾脏功能
通过定期检测血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的活性，可以动态观察肾脏功能的 变化，有助于及时调整治疗方案。
酶蛋白检测具有较高的灵敏度和特异 性，适用于研究目的的检测。
酶基因检测
酶基因检测是通过检测乙酰胆碱酯酶基因序列，从而了解基因突变、多态性等情况。常用的检测方法包括基因测序、单倍型 分析等。
酶基因检测具有预测疾病风险、指导个体化治疗等优点，但操作复杂、成本较高。
03
血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的临床
血液透析患者中乙酰胆碱 酯酶的检测与临床应用
• 引言 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的检测
方法 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶的临床
应用 • 血液透析患者中乙酰胆碱酯酶检测的
临床意义 • 结论
01
引言
研究背景
血液透析是治疗肾功能衰竭的重要手段，但过程中可能导致患者体内乙酰胆碱酯酶 活性降低。
乙酰胆碱酯酶是人体内重要的神经递质代谢酶，其在血液中的活性水平与神经系统 疾病、肝病等多种疾病的发生和发展密切相关。
6,胆碱酯酶活性测定
实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。
2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。
3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。
（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。
2．恒温水箱(37±0.5℃)。
3．离心机。
4．分光光度计，10mm比色皿。
5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。
（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。
2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。
取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。
3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。
4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
出现黄色即弃用。
6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。
7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。
此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。
因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。
（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。
鱼乙酰胆碱酯酶(AchE)说明书活性
释。
200IU/L
5 号标准品
150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
100IU/L
4 号标准品
150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
50IU/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
25IU/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
活性浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液
20ml×1 瓶
7 终止液
6ml×1标准品（400IU/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板
12 孔×8 条
9 标准品稀释液
1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液
6ml×1 瓶
10 说明书
1份
5 显色剂 A 液
6ml×1 瓶
11 封板膜
用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
重症肌无力患者血乙酰胆碱酯酶活性测定及其临床意义
ａｖ ｎｅ ｒｈＮ ｕｏ，９ ９ ５ （ ） １ ３—１７ ｄ ａｃ．Ａ ｃ ｅ ｒｌｌ９ ，６ ２ ：６ ６
（ 收稿 ：０４—０ ２０ ７—１ ） ９
腰神经丛及坐骨神经 阻滞致局麻药急性 中毒 ２例
李勇帅 鲁开智 曹 剑
随 着腰 丛及 坐骨 神经 阻滞 在临 床麻 意识逐渐恢 复 ， 不能记 忆刚才所发生 的情 过快。 这就提醒我们 以后作 神经 阻滞 时虽 同时在 醉中的应用越来越 广泛 ， 其麻醉并发症也 况。 后再次作 坐骨神经 阻滞 ， 效果好 ， 顺利 然回抽 无血也应注意局麻药 中毒 ， 就相应增多 ， 院在进行腰丛及坐骨神经 完成 手术 。术后 病 人无不 良记 忆及 并发 麻醉前必须作好急 救药物及物 品的准备 ， 我 阻滞过 程中共出现 ２ 例局麻药急性中毒 。 现介绍如下 。 １ 临床资料
２ 许贤豪 ， ．神经免疫学 ．北 京： 京医科大学 巾囤协和医科大学 著 北 联合 出版社 ， ９２： ｌｌ—ｌ ５ ｌ９ ｌ３ １０
３ Ｈｅ ｚ ｎ ｅＴ．Ｔ ｅａ ｙｏ ａｔ ｅ ｉ ｍｖｓｗｉ ｈ ｌｎ ｓｅ ｅｉｈｂｔｒ— ｈ ｒｐ ｆＭｙ ｓｈ ｎａｇ ｉ ｔ ｃ ｏｉｅｔｍｓ ｎ ｜ｉ Ｓ ｈ ｏ
作 者单位 ： ４０ ８ 湖北省十堰 市郧阳医学 院附属东 风医院 （ ４２０ 张润 希 ） ３００ 杭 州市第一人 民医院 （ ； １０６ 李保 华 ） ４０ ２ 武 汉市华 中科 ； ３０２ 技 大学 附属同济医院 （ 徐金枝 ）
乙酰胆碱酯 酶活性 升高见 于脂肪肝 、肾病综 合 征、 甲状腺机能亢进 、 糖尿病 、 高脂血症 、 支气管哮喘 、 多发性硬化、 高血压 、 妊娠 、 癫痫 ， 女性在月经期或长
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实用医学杂志 ２ ０ 年第 ２ 卷第 １ ０５ １ 期
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试作者：陈志坚1 准备工作0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。
2 酶液制备SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。
然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。
将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。
3 酶活性抑制测试3.1 配药液参照脲酶实验3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH3.3 酶活测试在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。
这是未加药酶活力为E1。
在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
计算出此时酶活，为E2。
抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。
试验简报 小菜蛾乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力测定
[试验简报]小菜蛾乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶活力测定周先志，刘波*（福建省农科院生物技术中心）1前言通过田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，并测定不同温度下饲养的三龄小菜蛾幼虫的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力，发现抗性产生的原因。
通过测定小菜蛾不同龄期幼虫以及蛹和成虫的羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的比活力，发现其酶活差异，并找出其酶活最小的发育阶段，即耐药性最差的发育阶段，指导田间用药，并将田间三龄小菜蛾幼虫与网室内长期饲养的三龄小菜蛾幼虫的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶的活性作比较，发现抗性产生的原因。
2 材料与方法羧酸酯酶比活力测定参考Van Asperen(1962)的方法；乙酰胆碱比活力测定参考Ellman(1961)的方法；酶源蛋白质含量测定参考Bradford (1976)记述的考马斯亮蓝G-250染色法测定。
3结果与分析3.1 不同龄期小菜蛾幼虫及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力由表1可知不同龄期的小菜蛾幼虫α-NA羧酸酯酶的总活力和比活力均随龄期的增大而增大，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力最大，一龄小菜蛾幼虫总α-NA羧酸酯酶活力的最小，蛹的α-NA羧酸酯酶的比活力最小，蛹期的总活力要高于一龄幼虫，但比活力要低于一龄幼虫，这是由于一龄小菜蛾幼虫的蛋白质浓度要低于蛹。
小菜蛾蛹、成虫和一龄幼虫的α-NA羧酸酯酶比活力差异不显著，四龄小菜蛾幼虫的总活力和比活力与一龄小菜蛾幼虫的相比差异较大，分别是一龄的7.32和5.31倍。
表1 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫α-NA羧酸酯酶活力虫龄 总活力umol.min.头比值 比活力umol.min.mg比值1 2 3 4 蛹成虫2.0421×108.3993×10-31.1393×10-21.4943×10-24.8466×10-32.947×10-31.004.115.587.322.371.446.519×102.1454×10-23.2283×10-23.4630×10-25.231×10-36.6749×10-31.003.294.955.310.801.023.2 不同龄期小菜蛾幼虫以及蛹和成虫乙酰胆碱酯酶活力由表2可知，不同龄期的小菜蛾幼虫的乙酰胆碱的总活力和比活力均随虫龄的增大而增大，蛹的乙酰胆碱总活力高于四龄幼虫，但比活力低于四龄幼虫。
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乙酰胆碱酯酶酶活的测试
作者：陈志坚
1 准备工作
0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。
2 酶液制备
SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。
然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。
将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。
3 酶活性抑制测试
3.1 配药液
参照脲酶实验
3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱
0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH
3.3 酶活测试
在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。
这是未加药酶活力为E1。
在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。
在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。
计算出此时酶活，为E2。
抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100%
得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。