定向生物合成
微生物在医药领域的应用
四、抗生素的制备
获取菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品检验
成品包装
微生物在医药领域的应用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（1）菌种：菌种都是从自然界分离、纯化及选育后获得的。 这些菌种通常采用砂土管或冷冻干燥管保存。要经常进行 菌种选育工作，用人工方法加以纯化和育种，才能保持菌 种的优良性状不变。菌种制备要保持严格的无菌状态。
微生物在医药领域的应用
微生物的发酵
目前应用微生物工业把发酵由微生物扩大到植 物、动物，因此工业微生物学家将所有通过微 生物或其他生物细胞（动、植物细胞）或经过 生物工程改造了的“工程菌”的培养来制备工业产 品或转化某些物质的过程，统称为发酵。
微生物在医药领域的应用
微生物发酵的一般工艺
微生物发酵的一般工艺也就是利用深层培养，进 行微生物发酵生产所需要产品的过程。微生物发 酵一般分发酵与提取2个阶段。其生产的一般工艺 流程如下。
（2）孢子制备：将保藏的菌种进行培养，制备大量孢子供 下一步植被种子使用。需氧发酵制备孢子一般是在摇瓶内 进行，通过振荡，外界空气与培养液进行自然交换获得氧 气。培养基要含有生长因子和微量元素，且碳源或氮源不 宜过多，从而保证生产大量的孢子。还要严格控制培养基 的pH、培养温度、培养时间等条件。
（3）种子制备：使有限数量的孢子萌发、生长、繁殖产生 足够量的菌丝体，供发酵培养所用。在种子罐内微生物菌 丝大量生长、繁殖，因而缩短了下一步发酵罐内菌丝生长 的时间。种子罐中的培养液要尽可能与发酵液一致。而且 要有易吸收的碳源和氮源。
合体但靶位仍能保持其功能。 c. 细胞通透性的改变，使药物进入细胞内减少。
微生物在医药领域的应用
3、细菌耐药性产生的防止对策
微生物制药复习题(1)
微生物制药一、名词解释1、微生物药物：微生物在生命活动过程中产生的具有生理活性（或药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。
2、全化学合成法（化学合成法）：当某些微生物药物的化学结构已经明确且结构简单时，采用全化学的方法进行合成，制取微生物药物。
世界上第一个全化学合成的微生物药物--氯霉素。
3、生物合成法（微生物发酵法）：特定的微生物在一定的条件下生长繁殖，并在代谢过程中产生微生物药物。
利用微生物药物的特定理化性质，提取和精制发酵液中的微生物药物。
4、半化学合成法（半合成法）：利用化学方法改进生物合成的微生物药物，获得性能更优良的微生物药物。
5、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适环境下快速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变为人工环境下的优势种。
6抗生素：微生物产生的次级代谢产物，具有抑制它种微生物的生命活动甚至杀死它种微生物的作用。
7原生质体融合：用脱壁酶处理将微生物的细胞壁除去，制成原生质体，然后在高渗溶液的条件下采用物理，化学或生物的助溶条件，促进原生质体的融合，从而获得异核体或重组子技术。
8半合成药物：对本身是天然药物的结构进行修改而生成的新药就是半合成药物。
9前体：微生物从外界吸收或在代谢途径中形成，可被进一步转变为最终产物的化合物。
10初级代谢：具有明确的生理功能，对维持生命活动不可缺少的物质代谢过程11次级代谢：微生物在一定的生长时期（稳定生长期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。
12生源说：次级代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源。
（构建单位=前体）13次级代谢产物的生物合成：各种构建单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程。
14致死温度：杀死微生物的极限温度。
15致死时间：在致死温度杀死全部微生物的所用时间。
16热死时间：在规定温度下杀死一定比例的微生物菌体所用时间。
微生物在医药领域的应用
（二）教学要求1．掌握抗生素的概念、特点和医用抗生素的特点。
2．熟悉抗生素的效价和单位表示方法。
3．了解抗生素效价的生物测定方法、微生物在其他药物生产中的应用。
微生物种类多、数量大、个体小、面积大、新陈代谢能力强、吸收多、转化快、生长旺、繁殖速度快，广泛应用于制药工业中。
如抗生素、维生素、氨基酸、酶及酶抑制剂以及微生态制剂都有是利用微生物发酵制成的。
利用“工程菌”作为制药工业的发酵产生菌可生产出更多低成本、高质量的药物，使得微生物在制药工业中的应用前景更加广阔。
抗生素：是生物在其生命活动过程中所产生的， 能在低微浓度下有选择地抑制或影响他种生物 功能的有机物质。
概念 第一节、抗生素很早以前，人们就发现某些微生物对另外一些微生物的生长繁殖有抑制作用，把这种现象称为抗生。
随着科学的发展，人们终于揭示出抗生现象的本质，从某些微生物体内找到了具有抗生作用的物质，并把这种物质称为抗生素，如青霉菌产生的青霉素，灰色链丝菌产生的链霉素都有明显的抗菌作用。
根据抗生素的生物来源分类： 1.细菌产生的抗生素：多黏菌素和短杆菌肽等 2.放线菌产生的抗生素：链霉素、四环素等 3.真菌产生的抗生素：青霉素和头孢霉素等、 4.植物和动物产生的抗生素：蒜素、鱼素等。
一、抗生素的分类 根据抗生素的化学结构分类 1.B-内酰胺类抗生素：青霉素、头孢霉素 2.氨基糖苷类抗生素：链霉素、卡那霉素 3.大环内酯类抗生素：红霉素、麦迪霉素 4.四环素类抗生素：金霉素、土霉素等 5.多肽类抗生素：多黏菌素、杆菌肽。
根据抗生素的作用机制分类 1.抑制细胞壁合成的抗生素：青霉素、环丝氨酸 2.影响细胞膜功能的抗生素：多黏菌素等 3.抑制核酸合成的抗生素：丝裂霉素C 等 4.抑制蛋白质合成的抗生素：链霉素、四环素等 5.抑制生物能作用的抗生素：抗霉素、短杆菌肽 根据抗生素的作用对象分类 1. 抗革兰氏阳性细菌的抗生素：青霉素、红霉素等 2. 抗革兰氏阴性细菌的抗生素：链霉素、多黏菌素等 3. 抗真菌的抗生素：灰黄霉素、制霉菌素等 4. 抗病毒的抗生素：四环霉素 5. 抗癌的抗生素：丝裂霉素、阿霉素等抗生素种类产生菌化学结构作用对象作用机制青霉素真菌产生β－内酰胺类抗G+细菌的影响细胞壁合成链霉素放线菌产生氨基糖甙类抗G－细菌影响蛋白质合成红霉素放线菌产生大环内酯类抗G+细菌的影响蛋白质合成多粘菌素细菌产生多肽类抗G－细菌影响细胞膜通透性四环素放线菌产生四环素类抗病毒影响蛋白质合成灰黄霉素真菌产生多烯类抗真菌、病毒影响核酸合成二、医用抗生素的特点1.差异毒力大差异毒力：即抗生素对微生物或肿瘤细胞等靶体的抑制或杀灭作用，与对机体损害程度的差异比较。
代谢工程—周奕腾改+试卷
红色为11级真题试卷1.代谢工程:利用基因工程技术,有目的地对细胞代谢途径进行精确的修饰、改造或扩展、构建新的代谢途径,以改变生物体原有代谢特性,并与基因调控、代谢调控及生化工程相结合,提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学。
2.代谢工程的四大助手：1.组学技术,计算系统生物学,这两种技术有助于代谢工程的分析方面2.蛋白质工程,合成生物学,有助于代谢工程的基因操作方面.3.三大代谢途径：糖酵解（EMP）、三羧酸循环（TCA）、磷酸戊糖途径（HMP）或称PPP4.两个应用实例：A、添加物导致代谢途径酶活加强：加维生素增强了磷酸果糖激酶活性和乳酸脱氢酶活性，增强了乳酸的生产B、加入葡萄糖酸钙能促进高6一磷酸葡萄糖脱氢酶和葡萄糖激酶的酶活力，促进了肌苷的合成4、酶调节方式、反馈调节方式：5、操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。
转录的功能单位。
很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。
主要见于原核生物的转录调控，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等6、分支代谢调节途径：A.同功酶调节：催化相同反应，但酶分子结构有差异；B.协同反馈抑制：一个不能少；C.累积反馈抑制：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；D.增效反馈抑制：1+1>2(末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。
只有当Y和Z同时过量，才能对E1产生较大的抑制作用。
)E.顺序反馈抑制：按①→②→③顺序逐步抑制；F.联合激活或抑制调节：途径产物各自调节，同一中间产物；7、会计算累积反馈抑制（试卷时60%，20%，68%）如30%和40%：30%*（100%-40%）+40%=58%8、不同谷氨酸生产菌的两大特征：α-酮戊二酸脱氢酶的缺乏;对生物素的需要(生物素缺陷型)9、代谢流(物流/通量)(flux)指流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。
内质网在生物合成中的功能
内质网在生物合成中的功能内质网（Endoplasmic Reticulum，ER)是细胞内的一个重要细胞器，它可分为粗面内质网和平滑内质网两种类型，其中粗面内质网具有许多附着的核糖体。
内质网除了是合成蛋白质的工厂外，还拥有多种其他的生物合成功能，成为一种非常重要的细胞器。
粗面内质网的生物合成功能粗面内质网是细胞内最主要的合成、折叠和修饰细胞蛋白的地方。
大部分的蛋白质合成都涉及到粗面内质网。
蛋白质的合成需要一些特定的酶和化学反应，这些酶在粗面内质网上由核糖体合成，然后与蛋白质结合。
一旦蛋白质被合成出来，它还需要得到进一步的修饰才能正确地折叠和达到生物学功能。
这些修饰是由粗面内质网上的酶完成的，包括截短、糖基化、磷酸化等等。
在粗面内质网上合成的某些蛋白质是由一组细胞信使分子控制的。
这些信使分子被称为转录因子，它们可以选择性地触发特定的蛋白质合成过程，从而实现蛋白质的定向生物合成。
这是粗面内质网合成的蛋白质具有生物多样性的主要原因之一。
此外，粗面内质网上合成的很多蛋白质还需要进行长周期的修饰，这使得他们可以在细胞内和细胞外的两个完全不同的环境中发挥生物学的功能。
平滑内质网的生物合成功能平滑内质网是一个没有核糖体的细胞器，它还是许多不同的生物合成过程的中心。
它产生的脂质被称为磷脂类物质，是构成细胞膜的主要成分。
平滑内质网还能代谢很多其他的物质，包括激素、荷尔蒙和荷尔蒙类药物等等。
平滑内质网在生物合成中还有其他非常重要的作用。
例如，许多细胞毒素和抗生素的合成都需要平滑内质网，它们在合成过程中都需要平滑内质网上的酶。
此外，平滑内质网还可以合成和分解甲状腺素，这是一个在身体内调节热量代谢和身体解毒的非常重要的代谢过程。
内质网的质量控制机制内质网能自动检测粗面内质网上合成的蛋白质质量，并在质量不佳时进行拒绝，从而保证最终合成的蛋白质都是生物活性的。
这种自动检测错误蛋白质的机制被称为内质网应激反应（ERM，Endoplasmic Reticulum stress response）。
定向合成技术
定向合成技术
定向合成技术是一种新兴的化学合成技术，它可以有效地控制分子的结构，实现有效的新分子的合成。
它可以帮助化学家们快速而准确地合成新分子，有助于改善生物分子的性质和功能。
定向合成技术的主要原理是通过控制合成反应的反应条件，以及选择合适的反应前驱体来实现控制分子结构的目标。
首先，要确定反应所需的反应前驱体，并经过合适的反应条件，以正确的模式将反应前驱体合成成指定的目标分子。
其次，通过使用有机合成中的精密实验技术，如催化反应，选择性活化，环加成等技术，来控制反应的进程，以达到预期的结果。
定向合成技术具有很多优点，可以帮助化学家们节省大量时间和金钱，提高反应效率，合成出高质量的产物。
而且，它也可以帮助研究人员更好地控制和优化化合物的性质和功能，以满足工业应用的需求。
定向合成技术也有一些缺点。
它的分子结构控制能力有限，而且反应的可控性也不是特别高。
此外，它的复杂性和复杂性也可能会增加反应的难度，影响反应的效率。
定向合成技术是一种非常有用的化学合成技术，它可以有效地控制分子结构，以及提高反应效率，合成更高质量的产物，有助于改善
生物分子的性质和功能，为应用研究提供新的机遇。
定向突变 生物合成
定向突变生物合成英文回答：Directed mutagenesis is a technique used in molecular biology to introduce specific changes or mutations into a DNA sequence. This technique allows scientists to study the effects of these mutations on gene function and protein structure. There are several methods available for directed mutagenesis, including site-directed mutagenesis and random mutagenesis.Site-directed mutagenesis is a targeted approach where specific nucleotides in the DNA sequence are changed to create a desired mutation. This can be achieved using techniques such as PCR-based mutagenesis oroligonucleotide-directed mutagenesis. For example, if I want to introduce a point mutation in a gene to study its effect on protein function, I can design a pair of primers that contain the desired mutation and use them in a PCR reaction to amplify the gene with the mutation.Random mutagenesis, on the other hand, introduces random mutations throughout the DNA sequence. This can be done using techniques such as error-prone PCR or chemical mutagenesis. Random mutagenesis is useful when studying the effects of a large number of mutations or when trying to create a library of variants with different properties.Once the mutations are introduced, the mutated DNA sequences can be cloned into an expression vector and used to produce mutant proteins. The mutant proteins can then be purified and characterized to determine their functional and structural properties. For example, if I introduce a mutation in a protein involved in enzyme catalysis, I can compare the catalytic activity of the mutant protein to the wild-type protein to understand the role of the mutated residue in the reaction.Directed mutagenesis has a wide range of applicationsin biotechnology and biomedical research. It can be used to study the function of specific genes and proteins, identify key amino acid residues involved in protein-proteininteractions, and engineer proteins with improved properties. For example, directed mutagenesis has been used to create enzymes with enhanced catalytic activity, antibodies with improved binding affinity, and receptors with altered ligand specificity.中文回答：定向突变是分子生物学中一种用于在DNA序列中引入特定改变或突变的技术。
研究天然产物生物合成的方法
研究天然产物生物合成的方法
一、定向进化(directed evolution)
1、酶工程：使用筛选技术对酶的活性进行改良；
2、基因重组：利用DNA的特性，将源于不同物种的基因段经过组合
或重组形成更强的基因；
3、蛋白质工程：改变蛋白质体系，增强蛋白质功能；
4、分子工程：利用合成生物学技术，合成一些有特殊功能的生物分子，并实现对它们的改造。
二、靶标驱动研究(Target-driven study)
1、利用生物信息学技术和分子模拟技术，考察特定活性位点，构筑优
秀的小分子名称，用以研究活性结构的构建与调节；
2、研究待合成的活性物质在活性位点的形成机制，以及活性位点突变
对活性的影响；
3、通过模拟、密码学以及比较分析技术，探索物种间天然产物合成途
径及调节机制。
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青霉素定向生物合成
青霉素和6－APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称
序号 1
青霉素分子的化学结构
H2N O
H C CH CN
S
CH3
C
CH3 CH COOH
6－APA的化学结构
各种天然青霉素具有的侧链和名称
侧
链
R
学
名
俗
名
HO
CH2
对羟基苄青霉素
其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的 底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物 质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。
定向生物合成与微生物新药的发现
次级代谢产物合成酶的特点： 是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。
参与催化反应的酶的底物专一性比初级代 谢合成酶要差。
应用实例
应用非遗传操作定向生物合成的方法能够 制备获得许多新的抗生素，其中目前已进 行工业化生产的有：
N(CH3)2 OH
3
9 10
10a 11
11a
12a 2
12
1
NH2
H
OH O
OH O
O
R5
R6
R76－去甲基四环素来自HHH
(1)
7－氯－6－去甲基四环
H
素
H
Cl
(2)
四环素
H
CH3
H
(3)
5－羟基四环素（土霉素）
OH
CH3
H
(4)
7－氯四环素（金霉素）
H
CH3
Cl
(5)
微生物发酵产生的一些四环素类抗生素
青霉素X
2
CH2
苄青霉素
青霉素G
3
H3C CH2 CH CH CH2
4
H3C (CH2)3 CH2
5
H3C (CH2)5 CH2
6
H2C CH CH2 S CH2
7 O CH3
戊烯[2]青霉素 戊青霉素
庚青霉素 丙烯巯甲基青霉素 苯氧甲基青霉素
青霉素F 青霉素二氢F
青霉素K 青霉素O 青霉素V
8
HOOC CH (CH2)2 CH2
四环类抗生素的定向生物合成
在生产金霉素时需添加氯化物作为前体， 而当生产四环素时，则必须要在发酵培养 基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或M-促 进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四 环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程 中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧 啶钠，能够获得去甲基金霉素。
杜拉克丁的定向生物合成
杜拉克丁的定向生物合成
组分 A1a A1b
A2a A2b B1a B2b B2a B2b
R1 OCH3 OCH3
OCH3 OCH3 OH OH OH OH
25-环己烷基-B2 25-环己烷基-B1
—OH —OH
R2 C2H5 CH3 CH3 CH3
X——Y CH=CH
CH=CH
CH3 CH3 C2H5 CH3 CH3 CH3
C2H5 CH3 CH3 CH3
CH2—CH（OH） CH2—CH（OH） CH=CH CH=CH CH2—CH（OH） CH2—CH（OH）
CH2—CH（OH）
CH=CH
备注
外源添加环 己烷羧酸钠
非基因改变定向生物合成的研究进展
尽管近年来基因改变的定向生物合成 发展很快，但利用非遗传操作定向生物合 成原理寻找新的生理活性物质的研究还在 不少实验室继续进行，特别是对一些肽类 如环孢菌素A、aureobasidins及糖肽类如 替考拉宁产生菌的定向生物合成研究取得
4－氨基－4－羧基 青霉素N
.
NH 2
丁基青霉素
培罗霉素定向生物合成 .
培罗霉素定向生物合成 ——可结合进入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物
H2N CH2 CH2 NH2
H2N CH2 CH NH2
.
CH3
H2N (CH2)3 NH CH3
H2N (CH2)3 N(CH3)2
H2N (CH2)3 N(CH 3)2X-
天然产物 化学 修饰
(1) 诱变处理 (2) 基因操作
(1)
(2)
阻 断 或 非 阻 杂合
断菌株
工程菌
前体物质
微生物或 酶转化
天然产物 衍生物
天然产物 衍生物
化学修饰 生物转化与 组合生物转化
天然产物 类似物
定向与杂交 生物合成
天然产物 类似物
突变生物 合成
天然产物 类似物
组合生物合成
微生物药物生物合成 与微生物新药发现的基本途径
即在微生物培养过程中，外源添加的某一 化学物质，通过微生物的代谢，能够将其 整体地或部分地整合到某一特定的次级代 谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或 苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。
非遗传操作的定向生物合成
这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质， 使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到 产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种 前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物 合成。
但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛 性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程 中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可 以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物；
这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之 为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。
前体（precursor）
微生物药物的生物合成 微生物新药的发现
根据微生物药物的生物合成原理 发现微生物新药的方法和途径
通过非基因定向改变、基因定向改变，以 及组合生物催化的技术，或是改变原有微 生物药物的生物合成途径，或是对原有的 微生物药物（或先导化合物和中间体）进 行生物催化，以发现微生物新药 .
产生菌
天然中间物
通过非基因定向改变的方法包括：定向生 物合成、杂交生物合成、突变生物合成， 以及生物转化与组合生物转化；
基因定向改变，即为组合生物合成。
第一节 生物合成途径的非基因定向改变
与微生物新药的发现
一、非遗传操作的定向生物合成 与微生物新药的发现
已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生 物合成中酶－底物的特异性足以使结构相关的 代谢产物在其发酵液中积累；
CH3
H2N (CH2)3 NH (CH2)3 OH
H2N (CH2)3 NH (CH2)3 OCH3
*H2N (CH2)3 NH CH
H2N
CH2
CH3
CH2
H2N (CH2)3 NH
NH 2
* PEP的末端胺基
四环类抗生素的定向生物合成
R7 HO
R6H R5 H H
7 8
6 6a
5 5a
4 4a
H2N (CH2)3 N H2N (CH2)3 N
H2N (CH2)3 N
O
H2N (CH2)2 N
NH
H2N (CH2)3 NH (CH2)3 N(CH3)2 H2N (CH2)3 NH CH2
H2N (CH2)3 N (CH2)3 NH2
CH3 H2N (CH2)3 NH CH
(CH2)2 NH2