高效液相色法
高效液相色谱法的实验操作指南
高效液相色谱法的实验操作指南高效液相色谱法是一种广泛应用于各个领域的分析技术。
它通过将溶液在高压下通过固定好的柱子进行分离，可以快速、准确地测定样品中的成分。
本文将介绍高效液相色谱法的实验操作指南，包括仪器和试剂准备、样品制备、色谱条件设定等。
首先，进行高效液相色谱实验前，准备好所需的仪器和试剂是必不可少的。
一般情况下，实验使用的仪器包括高效液相色谱仪、进样器、柱温箱等。
在使用前需要进行仪器的检查和校准，确保各项参数正常。
此外，还需要准备好色谱柱、移液管、吸管、试剂瓶等实验所需的小工具。
对于试剂的选择，需要根据实验的目的和需要选择适当的溶剂和试剂浓度。
其次，样品的制备是高效液相色谱实验中的重要一步。
样品的制备需要根据实验的具体要求进行。
一般情况下，可将样品溶解于适当的溶剂中，并进行必要的稀释。
在样品制备过程中，需要注意样品的溶解度、稳定性以及是否需要进行预处理等因素。
在进行实验时，色谱条件的设定是至关重要的。
首先，选择合适的柱子和移液管进行分离，根据需要设定流速和柱温。
其次，根据实验目的和需要，选择适当的流动相。
流动相的选择基于试剂的性质、溶解度以及对样品成分的分离效果等因素。
在色谱条件的设定过程中，需要进行系统的优化，比如调整流动相组分和浓度、柱温等参数来提高分离效果。
在进行实验时，操作的细节也需要特别关注。
首先，在进行进样时，需要控制好样品的体积和进样速度，以免影响实验结果。
另外，在进行分离时，需要注意观察波峰的形态和峰面积，以判断分离效果的好坏。
最后，在实验结束后，需要及时清洗仪器和柱子，并妥善保存。
高效液相色谱法的实验操作指南不仅涵盖了仪器和试剂的准备，还包括了样品制备和色谱条件设定等方面的内容。
在进行实验时，需要注意细节，并进行适当的优化和调整，以保证实验结果的准确性和可靠性。
通过遵循实验操作指南，我们可以更好地掌握高效液相色谱法的实验技巧，为科研工作提供有力的支持。
希望本文的介绍能够对读者有所帮助，促进高效液相色谱法的应用和发展。
高效液相色谱分析法剖析课件
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。
高效液相色谱法操作规程
高效液相色谱法操作规程目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。
范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。
责任者：QC主任，设备使用人员。
规程：依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。
1 ?定义及概述：1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2. 高效液相色谱仪的使用要求：2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3. 操作前的准备：3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
高效液相色_PPT幻灯片
保留时间（retention time,tR）：从进样开 始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时 间。
分离度（resolution,R）：相邻两峰的保留 时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率， 表示相邻两峰的分离程度。
拖尾因子（tailing factor,T）：T=B/A,用以 衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子 （symmetry factor）或不对称因子。
预柱与保护柱：
在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用 寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根 预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相 中的杂质，使其不污染分析柱。
为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中 的杂质污染，常在进样器与分析柱之间， 装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为 保护柱。
保护柱 （预柱）
(二) 进样器
进样阀（六通阀）、自动进样装置
六
通
进
样
进样针
阀
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：
(三) 色谱柱
由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价
比如色谱柱的分离效率、对指定溶质的选择性、在不 同PH介质中的稳定性、重现性、色谱柱压力、柱子 的样品负载量、回收率等等。 通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在 柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。
工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分 光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长 的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维 光谱－色谱图。
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器(fluorescence detector；FD)
《高效液相色谱法》
举例：巴比妥类药物
苯巴比妥、苯妥英和卡马西平均为临 床上常用的抗癫痫药，其药物浓度与疗效 和毒副反应密切相关。临床上常将三种药 物同时使用，为提高疗效，减少毒副作用 与个体差异，为超剂量中毒诊断、治疗与 及时调整给药方案提供科学依据，临床上 要进行血药浓度检测，而高效液相色谱法 是最常用的方法之一。
编辑ppt
反相高效液相色谱法
即指流动相的极性大于固定相极性的色 谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固 定相，流动相采用水——甲醇或水——乙腈 系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离 时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此 适合于共存组分极性差异较大的样品分析。 如高效液相色谱测定硫酸阿托品片的含量。
编辑ppt
反相离子对色谱
是分离有机离子的有效方法，离子对试剂和其 他添加剂的选用规则：1.样品中含有—COOH,— SO3H基团时，选用的离子对试剂应是带正电荷的 有机铵盐，以增加样品阴离子在反响色偶中的保 留值，选用的流动相一般是甲醇/水；2.除了加入 离子对试剂，还要加入磷酸盐或者其他缓冲液， 以控制流动相的酸度；3.样品中含有—NH2和— NH基团或其他阳离子时，选用的离子对试剂应是 烷基磺酸盐或硫酸盐；4.样品同时含有—NH2，— COOH,—SO3H等不同性质的基团时则以上规则 选用的离子对试剂和添加剂都合理。
编辑ppt
举例：
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
高效液相色法分离芳香烃ppt
在环境监测中的应用前景
污染源监测
高效液相色谱法可以用于监测工业废水和废 气中的芳香烃，了解污染源的排放情况。
生态风险评估
通过高效液相色谱法对环境中的芳香烃进行检测， 可以评估其对生态系统的风险，为环境保护提供科 学依据。
土壤和地下水监测
高效液相色谱法可以用于监测土壤和地下水 中的芳香烃，了解环境污染的程度和范围。
03
高效液相色谱法分离芳香烃的 实验条件
流动相的选择
总结词
流动相的选择对芳香烃的分离效果具 有重要影响。
详细描述
流动相的选择应考虑芳香烃的溶解度、 分离效率和实验操作条件。常用的流 动相包括有机溶剂和水，应根据芳香 烃的性质和分离要求进行选择。
固定相的选择
总结词
固定相的选择对芳香烃的分离效果具有关键作用。
实验结果的应用
01
质量控制
过程优化
03
科学研究
通过高效液相色谱法分离芳香烃， 可以控制产品的质量，确保产品 的纯度和一致性。
根据实验结果，可以优化分离条 件和参数，提高分离效率和效果。
高效液相色谱法分离芳香烃在化 学、生物学等领域有广泛的应用， 为科学研究提供有力支持。
06
高效液相色谱法分离芳香烃的 优缺点
高效液相色谱法在芳香烃分离中的应用
芳香烃是一类具有芳香性结构的烃类化合物，在化学工业、医药、染料等 领域具有广泛应用。
高效液相色谱法在芳香烃分离中具有较高的分离效率和准确性，能够快速 分离和纯化各种芳香烃。
通过选择合适的固定相和流动相，高效液相色谱法可以实现对芳香烃的精 细分离和纯化，为后续的制备和应用提供高质量的原料。
流动相选择
根据待分离芳香烃的性质 选择合适的流动相，流动 相应具有良好的化学稳定 性和分离效果。
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
高效液相色谱
械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失 的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的 选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化 合物。
化学键合固定相的产生对液相色谱法迅速发展 起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的 一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固 定相上进行的。
组分分子与吸附剂表面活 性中心的刚性结构相适应时， 易于吸附，故成为分离几何异 构体的有效手段；不同的官能 团具有不同的吸附能力，因此， 吸附色谱可按族分离化合物。
邻 硝 基 苯 胺
间 硝 基 苯 胺 对 硝 基 苯 胺
例：几种取代位置不同的硝基苯胺 的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺 序：
３. 离子交换色谱
cs Vm K k cM Vs
（2）固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 气液色谱中使用的固定液在液液色谱中都可以 用，但由于液相色谱中流动相参与选择作用，所以 只需用几种不同的固定液即可。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称 为正相液－液色谱，它适用于极性化合物的分离。 其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。
Cd Dm H 2d p ( )u u Dm Dm Ds
该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别 在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要 因素是传质阻力项。
2 Cm d p
2 Csm d p
Cs d 2 f
提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质
速率；提高柱内填料装填的均匀性。
不易吸水，耐有机溶剂，能在70C以下，pH在2 8 范
围内正常工作。
化学键合相色谱法优点： ①适合于分离几乎所有类型化合物（非极性、极性和离
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色法
2．停留进样 停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，
可用于高压。 缺点：重新升压后会产生不稳，保留时
间和峰形重复性比较差。
高效液相色法
3．阀进样 结构和作用原理与气相色谱中所用的
高效液相色法
操作条件
GC：加温操作。 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。
高效液相色法
第一节 高效液相色谱仪
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
组成部件
主要部件：高压输液系统、进样系统、分 离系统和检测系统。 辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动 进样装置、数据处理系统。
六、高效液相色谱法
高效液相色谱法：以高压输出的液体 为流动相的色谱技术。 High Performance Liquid Chromatograph
HPLC
高效液相色法
高效液相色谱法的特点
1. 高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色 谱柱液； 2. 高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离； 3. 高灵敏度：采用高灵敏度的检测器; 4. 速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色 谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h ； 5. 应用范围更广。
第二节 液相色谱中的固定相和流动相
一、液相色谱固定相 二、液相色谱流动相
高效液相色法
一、液相色谱固定相
1．按固相材料的刚性程度分类
刚性固体
硅胶：用于液固色谱的固定 相，液相色谱的担体，化学 键合固定相基质材料。
硬质凝胶
聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而 成的多孔颗粒：只应用在离子 交换色谱和凝胶色谱中。
六通阀相同。 优点：进样准确，重复性好，适用于定
量分析，更换不同体积的定量管，可调整 进样量。
高效液相色法
高效液相色法
4．自动进样
由计算机自动控制定量阀，按预先编 制好的程序进行进样。
优点：可自动完成几十或上百个样品的 分析。在进行大量样品的分析时，使用自 动进样器操作可节省大量人力和时间。
缺点：装置成本高。
高效液相色法
HPLC与GC的比较
相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。
不同点：
分析对象
GC： 适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品， 不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品。占有机物的20%。
HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制， 适于 溶解后能制成溶液的样品；分子量大、 难气化、热 稳定性差及高分子和离子型样品。 占有机物的80% 以上。
固定波长紫外检测器
固定波长： 254 nm或280nm
高效液相色法
2．荧光检测器 工作原理：利用某些试样具有荧光特性 进行检测。 特点：高灵敏度、高选择性；
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
高效液相色法
高效液相色法
3．示差折光检测器
工作原理：折光指数与组成有关，连续检 测参比池和样品池中流动相之间的折光指 数差值。差值与浓度呈正比；
高效液相色法
V) 示差折光 (RI) 荧光(FD) 红外吸收 (IR) 极谱 电导 质谱
类型 选择性
最高灵敏度 （g/mL）
510-10
温度 影响
低
流速影 用于梯度
响
洗脱
无
可以
通用性
510-7
有
无
不可
选择性 10-12~10-9
低
无
选择性
~10-7
低
无
可以 可以
选择性 10-10~10-9
高效液相色法
低压梯度 ： 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或
多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压 泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。
高效液相色法
二、进样系统
进样方式： 隔膜注射器进样 停留进样 阀进样 自动进样器进样
高效液相色法
1．隔膜注射器进样
色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时 用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。
要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等。
高效液相色法
高效液相色法
2．梯度洗脱 作用：分离过程中改变流动相的组成 ，使所 有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。 基本方式：高压梯度、低压梯度。
高效液相色法
高压梯度： 利用两台高压输液泵，将两种不同极性
的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合 后进入色谱柱。
高效液相色法
流动相
GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar； 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。
HPLC： 流动相为液体； 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选
择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极 性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。
流动相种类较多，选择余地广。
特点：通用型检测器； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于
梯度洗脱。
分类：偏转式、反射式和干涉型三种。
高效液相色法
偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化 而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流 动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折 射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。
高效液相色法
高效液相色法
有
有
选择性
10-9
有
有
通用性
~10-8
无
无
高效液相色法
困难 不可 可以
1．紫外检测器 特点：
应用最广： 适于约有70％的样品。 灵敏度高： 线性范围大： 死体积小：（1mm × 10mm ，8 μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感。
分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵 列检测器。
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
三、色谱柱 组成：
包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常 采用优质不锈钢，柱长一般为5~40cm，内径 为1~6mm 。
高效液相色法
色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四 氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。
填充好固定相后的柱子有方向性，在使 用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标 的方向一致。
高效液相色法
基本流程
高效液相色法
高效液相色法
一、高压输液系统 包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度 洗脱等装置。
高效液相色法
1．溶剂脱气装置 作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中 的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。 脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱 气等。
高效液相色法
2．高压泵 作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保 证输出的流动相具有恒定的流速 。