同源重组的基因敲除(20200303180946)
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理引言随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。
同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。
本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。
基本原理同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。
其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。
这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。
在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。
通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。
步骤同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：1.设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。
外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。
2.制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。
敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。
3.细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。
转染后，对细胞进行培养和筛选。
4.筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。
只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。
5.鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。
PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。
应用场景同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：1.基因功能研究：同源重组基因敲除可以用于研究基因的功能和调控机制。
通过敲除特定基因，观察编辑细胞或生物体的表现差异，从而揭示该基因对生物体的重要性和功能。
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➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统
一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统王小利;姜闯;刘建华;刘喜朋【摘要】With the development of functional genomics, gene-knockout is becoming an important tool to elucidate gene functions in vivo. As a good model strain for archaeal genetics, Haloferax volcanii has received more attention. Although several genetic manipulation systems have been developed for some halophilic archaea, it is time-consuming because of the low percentage of positive clones during the second-recombination tion. These classical gene knockout methods are based on DNA recombination between the genomic homologous sequence and the circular suicide plasmid, which carries a pyrE selection marker and two DNA fragments homolo-gous to the upstream and downstream fragments of the target gene. Many wild-type clones are obtained through a reverse recombination between the plasmid and genome in the classic gene knockout method. Therefore, it is neces-sary to develop an efficient gene knockout system to increase the positive clone percentage. Here we report an im-proved gene knockout method using a linear DNA cassette consisting of upstream and downstream homologous fragments, and the pyrE marker. Gene deletions were subsequently detected by colony PCR analysis. We determined the efficiency of our knockout method by deleting the xpb2 gene from the H. volcanii genome, with the percentage of positive clones higher than 50%. Our method provides an efficient geneknockout strategy for halophilic archaea.%随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
运用pKOR1敲除SE1457 srrAB
In-frame deletion of srrAB （2464bp）
∆srrAB突变株鉴定
PCR鉴定
RT-PCR鉴定
srrA srrA srrAB srrB srrB
Western Blot鉴定
srrAB互补株构建
-∆srrAB（pCN51-srrAB） -∆srrAB（pRAB11-srrA） -∆srrAB（pRAB11-srrB）
细菌的遗传变异现象
• 细菌的变异现象
– 形态结构变异 – 菌落变异 – 毒力变异 – 耐药性变异 –…
细菌遗传变异的物质基础
• 染色体:一条环状双螺旋DNA，无核膜、裸 露于细胞质中，无组蛋白包绕，附着在横 隔中介体上或细胞膜上； • 与真核细胞不同，细菌基因组无内含子， 转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可 直接翻译成多肽
细菌遗传变异的物质基础
• 转座因子的特点：
– 能从染色体的一个位点转移到另一个位点，或 由一条染色体转移至另一条染色体 – 不能像质粒或噬菌体那样独立存在 – 能编码转座所需的转座酶，移动时携带转座必 需基因一起迁移 – 转座的频率很低，且插入的位点是随机的，不 依赖转座子和靶位点之间序列的同源性
• 常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部 曲思想
基因敲除的技术路线
• 构建重组基因载体（含同源片段的重组质 粒）； • 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入 受体细胞核内（待敲除菌株中）； • 用选择培养基筛选已击中的细胞（筛选重 组子）； • 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因 动物，对转基因动物进行形态观察及分子 生物学检测（筛选突变株）；
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种常用的基因编辑方法，它可以通过精确地改变某一特定基因的序列，从而实现对该基因的敲除或修饰。
同源重组基因敲除原理是基于DNA双链断裂修复机制的原理，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
下面我们将详细介绍同源重组基因敲除的原理及其应用。
首先，同源重组基因敲除的原理是基于DNA修复机制的。
在细胞中，DNA双链断裂是一种常见的DNA损伤形式。
细胞会通过两种主要的修复途径来修复这种损伤，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
在同源重组修复过程中，细胞会利用同源DNA片段来修复断裂的DNA，从而实现对目标基因的敲除或修饰。
其次，同源重组基因敲除的实现需要引入外源DNA片段。
这些外源DNA片段通常包含有与目标基因相同或相似的序列，以便在同源重组修复过程中与目标基因发生配对。
一旦发生同源重组，外源DNA片段会替代目标基因的部分或全部序列，从而实现对目标基因的敲除。
同源重组基因敲除技术在基因编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以了解该基因在生物体内的功能及其对生物体的影响，从而揭示基因与生物性状之间的关系。
其次，同源重组基因敲除还可以用于生物工程和生物医学研究。
研究人员可以利用这一技术来改良农作物、动物，甚至进行基因治疗，为人类健康和农业生产提供新的解决方案。
总之，同源重组基因敲除是一种重要的基因编辑技术，它基于DNA修复机制，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
这一技术在基因功能研究、生物工程和生物医学研究等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展，同源重组基因敲除技术将为人类社会带来更多的福祉和进步。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除
adhE 基因
重组 基因
经紫外分光光度法测定，重组菌株经诱 导表达后，乳酸脱氢酶酶活力为114. 8U/ml, 比原始菌株乳酸脱氢酶酶活高了3~4倍
中的应用。
途径工程（Pathway Engineering) ：
利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网 络、并通过DNA重组技术原理设计细胞代谢 途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的 应用性学科。
1．提高细胞已有的化学物质的产量；
许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上 冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为 基因家族的其他成员可以提供同样的功能； 对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性， 也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
五、展望
基因敲除技术在国外已是成熟技术，而国内的技术 相对落后，但是国内目前已有许多单位在一领域开 展了工作。 改造生物、培育新的生物品种，细菌的基因工程技 术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基 因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。 这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着 广阔的应用前景。
图1
同 源 重 组 原 理 图 示
单交换
双交换
图2
③、同源重组引起的基因敲除—真核细胞：ES细胞
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 技 术 路 线 外显子插有新霉素抗 性基因 （neor）作为 正选择
疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk)基因作为 负选择
根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同：逆 转录病毒可用于动物细胞的插入；植物细胞中农杆 菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可 用于细菌基因敲除。