蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考

蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。

适用范围蛋白原核表达。

实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。

（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。

（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。

（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。

（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。

（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。

（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。

（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。

（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。

注意：如果扩增片断先连T载体时，则完全没有必要添加保护性碱基；只有当直接对扩增片断进行酶切时，才必须添加，具体数量可参考试剂公司关于该酶切位点的说明）。

引物设计原则：（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

（3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用连续的碱基A。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

（4）引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

（6）ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。

引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5 kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

（8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

（四）目的基因扩增（聚合酶链式反应（PCR））参照分子克隆的方法进行，加入试剂如下（GenStar高保真酶，不同酶体系不同，具体参照相关酶说明书）PCR 反应体系（50 μL）：按下列顺序加样上游引物0.3~0.5 μL下游引物0.3~0.5 μL2×superstar Mix 10 μLcDNA 1 μLddH2O 补齐到总体积50 μL Total 50 μL反应程序：预变性变性退火延伸98℃98℃60℃（引物 Tm 值）72℃30 s10 s20-30 s30 s终延伸30 cycles72℃10 min 4℃保存（五）基因克隆及和序列分析采用生工胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片段，与平模端载体16℃连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞，将菌体均匀涂于含抗性的LB固体平板（LB平板中具体加入哪种抗生素要依据不同质粒具有哪种抗性而言）上进行蓝白斑筛选。

37℃倒置培养过夜后挑取单个白色菌落进行摇菌和酶切鉴定，对重组质粒进行菌液PCR和双酶切鉴定，鉴定为阳性的菌液送生工或英潍捷基有限责任公司测序。

T4 连接酶连接体系（载体：目的片段=1:7）载体0.5 μL目的片段7.5 μLT4 连接酶 1 μLT4 buffer 1 μLTotal 10 μL试剂盒：天根菌液PCR试剂盒2×Reaction Mix PCR反应体系（20μl）：按下列顺序加样上游引物 1 μL下游引物 1 μL2×Reaction Mix 10 μL菌液 1 μLddH2O 补齐到总体积 20 μL Total 20 μL反应程序：预变性变性退火延伸94℃94℃55℃（引物Tm值）72℃4 min10 s20-30 s10 min终延伸25 cycles72℃10 min 4℃保存（六）目的基因蛋白原核表达载体的构建将构建的克隆载体和目的载体用相同的两个酶进行双酶切，回收克隆载体酶切打来的目的片段以及酶切过的目的载体，用T4连接酶对酶切下来的目的片段和酶切的目的载体链接，采用与上面第5步相同的方法，对进行克隆、测序。

（七）目的基因在大肠杆菌中的原核表达将重组表达质粒转化BL21细胞，涂布于含有相应抗性LB固体平板上，37℃培养。

次日分别挑取单菌落接种于1 mL含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃活化过夜后，按1:100的体积比接种LB液体，待D600 nm 值达到约0.6时，加ITPG 至终浓度1 mmol/L，37℃诱导表达，分别于0、2、4、6 h及诱导过夜时收集菌液各1 mL，用10％分离胶进行SDS-PAGE检测。

（八） Western blotting 分析SDS-PAGE电泳后，采用半干转膜法将蛋白质转移到NC膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜后，用TBST洗三次，每次5 min。

依次加入一抗（鸡AIV阳性血清）、4℃过夜或者37℃1 h。

一抗回收后，用TBST洗NC膜，洗3次，每次5 min。

避光条件下孵育二抗，37℃ 1 h。

然后用TBST洗三次，每次5 min。

用扫膜仪扫膜成像。

二、纯化实验目的纯化原核蛋白适用范围His标签重组蛋白纯化实验试剂（一）Bind buffer：（1 L）组分：20 mM Na3PO4·12H2O，500 mM NaCl配制：称量试剂如下Na3PO4·12H2O：7.59 gNaCl：29.22 g将pH调至7.4后，用0.45 μm 滤器过滤。

根据后续试验具体情况添加咪唑配制杂蛋白洗脱液。

（二）Elution buffer（1 L）组分：20 mM Na3PO4·12 H2O，500 mM NaCl，500 mM imidazole （咪唑）配制：称量试剂如下Na3PO4·12H2O：7.59 gNaCl：29.22 gImidazole: 34 g将pH调至7.4后，用0.45 μm 滤器过滤。

以上试剂室温储存。

实验设备和材料填料Ni Sepharose TM 6 Fast Flow及纯化柱（GE 公司）。

操作步骤（一）样品准备重组表达菌经超声裂解后，10000×g离心10 min，用注射器小心地吸取上清液，用0.45 μm滤器过滤备用。

（如无需立即纯化，可暂存于-80 度冰箱）（二）装柱取填料2 mL加入纯化柱中，用超纯水洗5遍，除去储存液中的酒精，每次7 mL.（三）结合用Bind buffer洗3遍，每次7 mL，平衡柱子。

吸取7 mL样品加入柱中，回收滤过液，堵住下口，将滤过液重新加入到柱中，堵住上口，温和的颠倒混匀，使填料均匀重悬，4℃垂直静置30 min（此处可延长时间）。

打开上下柱口，将滤过液再次过滤。

滤过液取样备用。

用Bind buffer洗5次，每次4 mL。

（四）梯度洗脱吸取2 mL 20 mM咪唑洗脱液（向Bind buffer中添加咪唑即可制备）加入柱中，弃掉滤过液，再次加入2 mL后收集滤过液备用。

用2 mL20 mM 咪唑洗脱液再洗，直至OD280（用该浓度洗脱液作为空白调零）变为0，收集滤液。

用同样的方法，依次用浓度为100 mM，150 mM，200 mM咪唑的洗脱液咪唑洗脱液，收集滤液备用。

最后用Elution buffer洗脱至OD280变为0，测定滤液浓度并做好标记（标记内容包括洗脱液浓度，管号，日期和滤过液浓度）。

（五）洗柱及保存用Bind buffer清洗柱子，每次7 mL，清洗5次。

加入2 mL Bind buffer 将柱子储存于4℃冰箱。

（如需长期储存，则用20%的乙醇储存于4℃）（六）电泳检测纯化情况选取各浓度洗脱的蛋白中浓度最高的那管，加入loading buffer 后煮沸10 min，进行电泳。

电泳后用考马斯亮蓝染色液对蛋白胶染色30 min，用脱色液脱色后，比对各浓度洗脱液洗脱后蛋白条带的差异，选取洗脱杂蛋白较多而目的蛋白较少的浓度作为杂蛋白洗脱浓度（也可直接作为结合液使用）。

选取目的蛋白完全洗脱的浓度作为最终的洗脱浓度（也可直接选用Elution buffer）。

注意事项1、整个过程低温进行效果更佳，纯化应一气呵成，不要分成两天做。

2、如果没有目的条带，有可能未表达成功，也有可能是未结合或Bind buffer与Elution buffer混用，应将上清原液和滤过液一起跑胶，检测表达与结合情况。

3、如果选用的洗脱液梯度不能满足实验需要，可进一步细化洗脱梯度，合适的杂蛋白和目的蛋白洗脱浓度。

4、建议纯化之前菌液进行大摇，每个菌摇2L备用，并在纯化前检验表达情况，未用完的蛋白-80 度储存。