实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
兽医药理学教学实践结题报告——纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性
兽医药理学实践教学结题报告纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性专业班级：指导老师：完成时间：实践地点：大肠杆菌对6种抗生素的敏感性检测（四川农业大学动物医学2009级1班）摘要：大肠杆菌病(Colibacillosis)是由致病性大肠杆菌引起的消化道传染病，流行广，发病率和死亡率较高。
这种病原菌主要经动物的消化道而感染。
能够引起多种畜禽发生急性、慢性或隐性感染。
药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。
通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。
以防盲目地滥用抗菌药物,造成药物的浪费,同时也贻误了治疗时机，会给养殖户造成了很大的经济损失。
关键词：大肠杆菌抗生素敏感性前言：致病性大肠杆菌是引起动物感染最常见的病原微生物，它可引起畜禽发生严重腹泻和败血症等，给养殖业造成了巨大的经济损失。
抗菌药物的应用在很大程度上控制了这类病原菌的发生。
但是随着药物的广泛使用，尤其不合理用药，耐药细菌迅速产生，多重耐药现象日趋严重，严重影响抗菌药物的有效使用，给新药的开发带来巨大压力，同时也带来了动物源食品的安全性问题，对人类的健康构成了潜在威胁[1,2]。
本次实验初步了解了各场大肠杆菌耐药性的发生和流行现状，为养殖场合理用药提供依据。
一、实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
微生物实验 药物敏感实验
微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。
⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。
⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。
⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。
涂布均匀。
⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。
五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法是一种常用的检测细菌对抗生素敏感性的方法，其操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如Mueller-Hinton（MH）琼脂（常用于细菌药敏试验）。
按照制造商的
说明溶解固体培养基，并加入适当量的琼脂（通常为2%），
将其加热溶解，然后用无菌盘口装好。
2. 菌液制备：从培养基上的细菌菌落中接种一根病菌棒，将其浸入含有3-5毫升无菌盐水的试管中。
3. 菌液浓度调整：将试管中的细菌菌液用比例稀释至合适的浓度（通常为0.5麦克百尼尔/毫升）。
4. 纸片扩散：用无菌的棉签将稀释后的菌液均匀地涂抹在一块布拉格琼脂平板上，然后在琼脂上按要求摆放敏感纸片（一般为阿莫西林、头孢菌素等常用抗生素），注意要与纸片相距一定距离。
5. 培养：将布拉格琼脂平板反面朝上，用无菌培养皿盖好，然后放入恒温培养箱中进行孵育。
通常在35-37°C条件下培养
24小时。
6. 结果录入和解读：观察纸片周围的细菌生长情况，通过测量纸片周围形成的抑制圈直径来评估细菌对不同抗生素的敏感性。
根据抑制圈的直径大小，将细菌的敏感性分为敏感、中等和耐
药三个等级。
注意事项：
- 操作过程需要严格无菌，以免细菌的外源污染影响结果。
- 确保培养皿紧闭，避免细菌的空气传播。
- 操作前后要做好清洁，避免微生物交叉感染。
- 移栽过程要注意避光，避免紫外线对细胞的破坏。
抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
临床常用细菌药敏试验方法
临床常用细菌药敏试验方法
临床常用的细菌药敏试验方法主要包括：
1. 纸片扩散法：常用于测定细菌对抗生素的敏感性。
将含有不同抗生素的纸片放置在含有细菌的琼脂平板上，通过观察纸片周围出现的抑菌圈直径来判断细菌对抗生素的敏感性。
2. 微量稀释法：通过在微孔板中加入不同浓度的抗生素溶液，然后加入含有细菌的培养基，通过观察不同抗生素浓度下对细菌的抑制情况来确定细菌对抗生素的敏感性。
3. E测试法：通过在含有细菌的琼脂平板上放置带有梯度抗生素浓度的试纸，然后观察梯度上的细菌生长抑制情况，从而确定细菌对抗生素的敏感性。
4. 斑点法：将细菌培养在琼脂平板上，再在平板上分别滴入不同的抗生素溶液，通过观察抗生素对细菌的杀灭程度来判断细菌对抗生素的敏感性。
这些方法在临床中常用于确定细菌对各种抗生素的敏感性，以指导医生选择合适的抗生素治疗感染。
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实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
平板加盖室温干燥3分钟。
（4）标记：将上述平板皿底用记号笔分成若干等分，分别标明一种药敏片的名称。
纸片序号对应的药品：1.氨苄青霉素（penicillin）; 2,链霉素;3氯霉素，4庆大霉素Gentamycin. 5 四环素图抗生素抗菌谱的测定示意图①氨苄青霉素（penicillin）; ②链霉素;③氯霉素，④庆大霉素Gentamycin. ⑤四环素；⑥无菌水（5）贴滤纸片（待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片）：无菌操作，用镊子取无菌滤纸片（青霉素，链霉素，等）分别贴在平板上相应位置，在平板中央贴上仅有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。
轻压纸片使之紧贴琼脂表面（不要在培养基表面拖动滤纸片）。
注意：无菌操作，用镊子将药敏纸片贴在涂好菌的平板上，各纸片中心相距至少24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
在菌接种后15分钟内贴完纸片。
（6）培养，观察：将上述平板倒置于37℃保温培养24 h，观察并记录抑（杀）菌圈大小。
（7）37℃ 18-24小时后测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
（8）每次药敏试验必须用A TCC 25922大肠杆菌做质控。
只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。
ATCC 25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告在附表中。
五、实验报告（取出培养平皿，观察滤纸征周围有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈的大小。
将测量结果填入下表中）（）的抑菌环几乎没有，说明实验室的金葡对于（）耐药。
六、思考与讨论影响药敏试验结果的主要因素1、药物因素1）药物理化性质（1）药物溶解性：药品的溶解性决定了其能否在培养基上均匀扩散，难溶的药物无法完全扩散，所得实验结果会小于真实值。
药物稳定性：临床中常用的药物试纸片一般是事先加工好的，极少是现用现做的，所以药品试纸片中药物含量必然受到其稳定性的影响。
针对本次实验使用的抗菌药物：i.青霉素类在自然条件下是非常不稳定的，如青霉素钠或钾无论在酸性还是在碱性溶液中都会迅速分解，所以在加工药敏试纸片过程中以及将试纸片放置到培养基上时，溶剂和培养基的PH值都会造成药物效价的降低和药敏结果的降低。
ii.红霉素也是一种很不稳定的药物，它在弱碱情况下较为稳定，但是当PH小于6时红霉素会很快分解，导致药敏试验结果的降低。
2）药物作用特点（1）药物抗菌作用机理：临床中的抗菌药物可以简单的分成抑菌药物和杀菌药物两种。
杀菌药物产生的抑菌环边沿一般是非常明晰清楚，而抑菌药物产生的抑菌环边沿是模糊的。
所以在药敏试验结果判断上，抑菌药物和杀菌药物抑菌环（带）大小很难确定，并且随着培养时间的延长和药物的失效，抑菌药物抑菌环（带）边沿未被杀死的细菌有可能又恢复生长，从而导致抑菌环（带）的进一步缩小。
针对本次实验使用的抗菌药物：i.抑菌药物有：青霉素、红霉素、万古霉素ii.杀菌药物有：庆大霉素（2）作用适宜PH值：药物的作用强弱存在最适宜的PH值（3）药物有效部位：有些药物的抗菌作用是不能通过体外药敏试验来判断的，它们只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用（4）离子的影响：常用的许多药物可以受到各种离子的影响而导致抗菌作用降低甚至丧失。
如许多重金属离子（铜、锌、汞）等可以破坏青霉素钠(或钾)的活性，使其抗菌作用降低。
所以在进行药物敏感性试验时应该选用无离子水和高质量的营养琼脂。
（5）其他因素：药物自身性质影响因素还包括药物蛋白结合率、作用温度等多方面因素。
2、培养基1）培养基厚度：影响药物扩散，培养基厚度越大药物的抑菌环越小。
抑菌试验常用的培养基厚度一般为5mm左右。
2）用水的质量：主要是矿物质离子的影响，如Ca2+、Mg2+、Al3+等离子，它们可能使某些药物失活。
3）PH值：影响药物稳定性和活性。
4）培养基成分：培养基配制浓度较高或融化不良以及厚薄不均等均可能影响药物扩散；培养基中的蛋白质可能和部分蛋白质结合率高的药物结合而影响药敏试验结果。
药物蛋白质结合率如：青霉素≧50%、红霉素≧70%；而氨基糖苷类药物结合率却很低（20%左右）。
培养基中的杂质的种类也可能在某些方面影响药敏试验的结果。
3、细菌因素细菌的菌层厚薄（或涂菌的多少）和细菌生长的特性是影响药敏结果的主要因素。
药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌环就越小，反之抑菌环就越大。
有些细菌在培养基上生长时会发生移动（鞭毛运动），当药物失效或培养时间太长，这类细菌有可能向已经形成的抑菌环移动，这也导致抑菌结果判断的失误。
4、试纸片因素1）药物含量的多少：试纸片上药物含量的多少应该是影响药敏结果的最主要因素。
由于纸片法药敏试验本身就是一种定性药物敏感性试验，试纸片含药量没有统一规定，各个生产单位都是根据各自的标准进行加工，所以试纸片药物种类和含量不同判断标准也不同，药物之间没有明确的可比性。
目前许多兽药企业自己生产药敏试纸片和产品的药敏试纸片，有的企业为了提高产品的药敏结果而加大产品药敏纸片中药物含量也在所难免，所以通过药敏试验中抑菌环大小来判断细菌对不同药物的敏感性是不严谨的。
2）试纸片材质：试纸材质对药敏试纸片中药物稳定性以及活性有很大影响。
加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的定性或定量滤纸，这种滤纸含有杂质少，对药物保存没有太大影响。
但是，临床中许多企业加工的是纸片是选用普通纸，这些普通纸用水浸润后一般为碱性或含有大量无机离子，使用普通纸加工的试纸片药物受到很大影响。
也有些企业使用薄型的滤纸片，加工过程中药物不可能被滤纸片均匀吸收，试纸片药物含量不均必然导致药敏试验结果的不确定。
5、培养条件药敏试验中培养时间的长短、温度的高低等都是影响药敏试验结果的因素。
抑菌药物的抑菌环边沿是一个模糊范围，当培养时间过长或药物失效，药物的抑菌环大小也就会发生改变；细菌的移动性在培养时间过长时也会影响试验结果的判断；培养温度的高低可以影响细菌的生长状况，这也间接影响药敏试验的结果。
注意事项：(1) 制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。
琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。
倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。
pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。
(2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。
使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。
过期纸片不能使用, 应弃去。
(3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。
(4) 保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。
然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。
每月取出一支，传出细菌供常规用。
待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。
如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。
质量控制：质量控制方法是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。
应使用新鲜传代的菌种。
接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。