细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)简介：自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。
单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine ,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长。
阻断滤光片波长。
Leagene 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，适用于培养细胞的自噬染色，又称为MDC 染色液，可与EB 合用双染。
组成：自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 EB4、 载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：(一)、MDC 单独染色：1、 用去离子水稀释1×Wash buffer 。
2、 离心，收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞，弃上清。
3、 加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度。
4、 取适量的细胞悬液至新的EP 管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。
5、 室温避光染色15～45min 。
6、 离心，收集细胞，用 1×Wash buffer 清洗细胞，弃上清。
7、 加入Collection buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。
编号 名称 DA0041 Storage 试剂(A): MDC Stain 1ml -20℃ 避光 试剂(B): 10×Wash buffer 20ml 4℃ 试剂(C): Collection buffer 10ml 4℃ 使用说明书 1份8、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长，阻断滤光片波长)，计数并拍照。
(二)、与EB双染色：1、用去离子水稀释1×Wash buffer至1×。
碧云天细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)说明书
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介：碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。
自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。
自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。
自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。
由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。
MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。
MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体(autophagosome)，也称autophagic vacuole ，因而常用于细胞自噬的检测。
MDC 是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC 染色，因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。
本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测，不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。
使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察，也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。
荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发，发出绿色荧光。
荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可)，发射波长为512nm (510-540nm 均可)。
本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。
图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。
细胞自噬预实验
细胞自噬预实验化学染色法1、试验目的通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。
2、试验原理3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。
所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。
3、试验材料及试剂HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。
实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。
4、试验方法1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物处理48h。
2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。
3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。
4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。
MDC染色液
MDC 染色液简介：自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。
单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm 。
Leagene MDC 染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB 合用双染。
产品组成：自备材料：1、 低速离心机2、 1.5ml 离心管3、 载玻片、盖玻片4、 荧光显微镜操作步骤(仅供参考)：1、 收集细胞，用300～500μl 的Wash buffer 清洗细胞1次，800～1000g 离心5min ，弃上清。
2、 加入适量的Stain buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。
3、 取90μl 细胞悬液至新的1.5ml 离心管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。
4、 37℃或室温避光染色。
5、 800～1000g 离心5min ，弃上清，收集细胞，用Wash buffer 清洗细胞2次，800～1000g 离心5min ，弃上清。
6、 加入Wash buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。
7、 荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm)，计数并拍照。
(二)96孔板法1、 配制MDC 染色工作液：按MDC Stain ：Stain buffer=的比例混合，即为MDC 染色 编号 名称 DA0040 Storage MDC Stain 2×1ml -20℃ 避光 使用说明书 1份工作液。
如不能及时用完，应-20℃避光保存。
2、轻轻吸除96孔板中的培养液，加入MDC染色工作液至各孔，37℃5%CO2避光孵育。
细胞凋亡、自噬、坏死
束生命的过程。从形态学上看，首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去
微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝
聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚
集在一起，被反折的细胞膜包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状
突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptotic body)；最后凋亡
一、细胞凋亡、自噬、坏死概念
细胞死亡是指细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和
功能丧失等不可逆性变化，其一般分为程序性细胞死亡和非程序细胞死亡，细胞
凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)属于前者，细胞坏死(necrosis)属于后者。
细胞凋亡是一个主动的通过调控一系列基因的活化和表达等使细胞自动结
植物）中，为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或
有缺陷的细胞器。
细胞坏死是一个被动的因极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的
细胞损伤和死亡。细胞坏死的结局与细胞凋亡类似，坏死过程中细胞膜通透性增
高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，染色质随机降解，早期核无明显形态学
变化，最后细胞破裂；另外坏死的细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，
细胞坏死
四、检测方法 细胞凋亡检测方法在之前已经讲过，此处就不列举了。 细胞自噬检测方法： 1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自 噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构， 继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体
被 双 层 膜 结 构 的 变形或肿大
自噬泡包裹，最终
蛇葡萄素通过PI3K
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＢＩ２５３６ａｎｄＧＷ８４３６８２ＸｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＡ５４９ａｎｄＨｅＬａｃｅｌｌｓａｎｄｂｌｏｃｋｅｄｔｈｅｍｉｎＧ２／Ｍｐｈａｓｅ．Ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ（ＰＳ３４１）ｗｅａｋｅｎｅｄｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓｂｌｏｃｋｅｄｉｎＧ２／Ｍｐｈａｓｅａｎｄａｂｎｏｒ ｍａｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｉｎＥ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｂｏｒｔｅ ｚｏｍｉｂｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｕｓｅｏｆｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂａｎｄＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｓｈｏｕｌｄｂｅｃｏｎ ｓｉｄｅｒｅｄｔｏｈａｖｅｔｈｅｒｉｓｋｏｆｄｒｕｇｅｆｆｉｃａｃｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｉｔｉｓｓｐｅｃｕｌａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｉｎｖｏｌｖｅｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｃｙｃｌｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ；ｔｕｍｏｒｐｒｏｌｉｆ ｅｒａｔｉｏｎ；Ｇ２／Ｍｐｈａｓｅ；ｃｙｃｌｉｎｓ；ｃｙｃｌｉｎＥ１网络出版时间：２０２３－１０－３０１８：５７：０８ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１０２７．１５３３．０４０蛇葡萄素通过ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ通路诱导人宫颈癌细胞ＳｉＨａ自噬邹 雪，熊晓妹，杨晓利，廖思雨，许诗怡，张秀桥，桂 春（湖北中医药大学药学院，湖北武汉 ４３００６５）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０６０４８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１１－２１２１－０８中国图书分类号：Ｒ２８２ ７１；Ｒ３９２；Ｒ３９４ ２；Ｒ７３７ ３３摘要：目的 研究蛇葡萄素（ａｍｐｅｌｏｐｓｉｎ，ＡＭＰ）诱导人宫颈癌细胞ＳｉＨａ发生自噬及其可能的作用机制。
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【摘要】目的探究中波紫外线(UVB)诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT自噬效应及其信号通路.方法 30 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后,透射电镜和MDC染色法观察自噬小体的变化,Western Blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化.结果 30mJ/cm2 UVB照射24 h后,电镜下可见自噬小体增多,内含待降解的细胞器和折叠蛋白;MDC染色可见细胞自噬囊泡增多,荧光强度增强;Western Blot结果显示自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和SQSTM1表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达增加,p-mTOR表达降低;运用3-Methyladenine(3-MA)和siATG5抑制自噬后,LC3-Ⅱ表达降低,细胞凋亡率增加,增殖减慢,凋亡蛋白Cleaved-PARP表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达下降,p-mTOR表达增加.结论 UVB通过AMPK/mTOR通路诱导了HaCaT细胞的保护性自噬.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)012【总页数】6页(P1910-1914,1919)【关键词】中波紫外线;人永生化角质形成细胞;自噬;凋亡【作者】王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【作者单位】南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515【正文语种】中文日光中的紫外线，尤其是中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人体表皮细胞损伤最常见的环境因素之一。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)
简介：
自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。
单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm 。
阻断滤光片波长512nm 。
Leagene 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，适用于培养细胞的自噬染色，又称为MDC 染色液，可与EB 合用双染。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
(一)、MDC 单独染色：
1、 用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。
2、 离心，收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。
3、 加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。
4、 取适量细胞悬液至新的EP 管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。
5、 室温避光染色。
6、 离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞2次，弃上清。
7、 加入Collection buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。
8、 荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm)，计数并拍照。
(二)、与EB 双染色：
1、 用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。
2、 离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。
3、 加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。
4、 取适量细胞悬液至新的EP 管中，分别加入MDC Stain 和 EB 染色液，轻轻混匀。
5、 滴加于在玻片上，室温避光染色，加盖玻片。
编号 名称 DA0041 Storage 试剂(A): MDC Stain 1ml -20℃ 避光 试剂(B): 10×Wash buffer 20ml 4℃ 试剂(C): Collection buffer 10ml 4℃ 使用说明书 1份
6、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长512nm)，计数并拍照。
染色结果：
正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光
凋亡细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被
染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒
注意事项：
1、MDC Stain和EB，试剂有一定毒性，请小心操作。
2、吖啶橙染色常与EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。
3、操作过程中应注意减少试剂暴露于强光下的时间。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。