军团菌的分离培养与鉴定
1992
发现时间
1993 1993 1993 1993 1993 1994 1996 1996 1999 2001 2001 2001 2001 2001 2003 2004
Species
No. of serogroups
No. associated with disease
1. L. pneumophila
2 1
2 1
团
11. L. birminghamensis
1
1
菌
12. L. cincinnatiensis
1
1
可
13. L. gormanii
1
1
引
14. L. sainthelensi
2
2
起
15. L. tucsonensis 16. L. anisa
1 1
1 1
人
17. L. lansingensis
Legionella shakespearei
发现时间
1985 1985 1985 1985 1985 1985 1986 1988 1989
1989 1989 1990 1990 1991 1991 1991
种名 Legionella geestiana Legionella londiniensis Legionella nautarum Legionella quateirensis Legionella worsleiensis Legionella lansingensis Legionella lytica Legionella waltersii Legionella taurinensis Legionella beliardensis Legionella drozanskii Legionella fallonii Legionella gresilensis Legionella rowbothamii Legionella busanensis Legionella drancourtii
病原菌名称
学名
中文名
危害程度 分类
实验活动所需生物安全实验室级别
大量活菌 动物感
操作
染实验
样本 非感染性 检测 材料实验
运输包装分类
A/B
UN 编 号
15
15
2. L. bozemanii
2
2
2
3. L. dumoffii 4. L. micdadei
1 1
1 1
0
5. L. longbeachae
2
2
个
6. L. jordanis
1
1
种
7. L. wadsworthii
1
1
的
8. L. hackeliae
2
2
军
9. L. feeleii 10. L. maceachernii样，具有多型性.
军团菌
军团菌
军团菌电镜图片
军团菌科、属、种、血清型
军团菌科 (Legionellaceae ）
Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei
军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系γ亚群中， 军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细 胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。
军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型
（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。
军团菌种
种名 Legionella pneumophila Legionella bozemanae Legionella dumoffii Legionella gormanii Legionella micdadei Legionella pittsburghensis Legionella jordanis Legionella longbeachae Legionella oakridgensis Legionella wadsworthii Legionella feeleii Legionella sainthelensi Legionella anisa Legionella cherrii Legionella erythra Legionella hackeliae
1
1
疾
18. L. erythra
2
1
病
19. L. parisiensis
1
1
20. L. oakridgensis
1
1
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。
《可感染人类的高致病性病原微生物菌 （毒）种或样本运输管理规定》
军团菌的分离培养与鉴定
福建省疾病预防控制中心 原灵
2009年6月3日
军团菌
• 革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径 0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长， 菌体一端有鞭毛.
• 在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼 脂培养基上生长，通常需要在37℃
5%CO2培养箱培养2-10天。
• 生长形成的菌落一般呈白色，也可能 会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。
Legionella jamestowniensis
发现时间
1979 1980 1980 1980 1980 1980 1982 1982 1983
1983 1984 1984 1985 1985 1985 1985
1985
种名 Legionella maceachernii Legionella parisiensis Legionella rubrilucens Legionella santicrucis Legionella spiritensis Legionella steigerwaltii Legionella israelensis Legionella birminghamensis Legionella brunensis Legionella cincinnatiensis Legionella moravica Legionella quinlivanii Legionella tucsonensis Legionella adelaidensis Legionella fairfieldensis Legionella gratiana
(完整版)军团菌及其检测方法
3. 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 4. 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 5. 灭菌棉拭子。
一般建议用塑料包装的容器
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒） 种或样本运输管理规定》
病原菌名称
• 注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的 间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无 杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来 源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
常见几种系统采集部位
冷水系统的采集： • 进水系统 • 蓄水池 • 与每个蓄水池相连的下水道的排出口 • 蓄水池最远的下水道的排出口
Part III：军团菌的分离与检测
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
水样标本中军团菌的分离方法
检测依据:
《公共场所集中空调通风系统卫生 规范》中的集中空调通风系统 冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌 的检验方法见附录B。
适用于各种环境标本军团菌检 测 ，包括： 饮用水、工业用水、 天然水以及一些如沉积物、沉 淀物、软泥等物质。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
军团菌检测所需准备基本试 剂
1. 培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS) 2. 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液） 3. 酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液
（0.03mol/L KOH） 4. 血清学试剂
军团菌检验方法实施细则
军团菌检验方法实施细则1适用范围：本细则适用于各类样品中军团菌的检测鉴定。
2检测依据：国家《传染病诊断标准》WS195-2001 军团病诊断标准及处理原则军团病诊断标准及处理原则，卫生部，2002年上海市卫生防疫站1979；卫生防疫细菌检验，第一版，上海科技出版社3设备与材料3.1冰箱：4～-20℃。
3.2恒温培养箱：36±1℃。
3.3振荡器3.4显微镜40x 100x3.5离心机12000rpm3.6架盘药物天平：0 g -500g, 精度0.5g。
3.7锥形瓶：100 mL、500 mL。
3.8灭菌吸管：1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.9灭菌平皿：直径90 mm。
3.10灭菌试管：16 mm×160 mm.。
一般用的是18*180mm3.11 温水浴箱：36±1℃3.12 二氧化碳培养箱：5%CO236±1℃3.13 紫外灯3.14 过滤器4培养基和试剂4.1 BCYEα琼脂成份：N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸（ACES） 10.00 克氢氧化钾片（85%KOH 试剂级） 2.80 克活性炭（Norit A） 1.50 克酵母浸膏（Difco） 10.00 克琼脂（Difco） 17.00 克α-酮戊二酸（单钾盐） 1.00 克L-半胱氨酸盐酸盐（溶于10毫升蒸馏水中） 0.40 克焦磷酸铁（溶于10毫升蒸馏水中） 0.25 克蒸馏水 1000 毫升4.2甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B（GVP）琼脂成份：除上述每升BCYEα琼脂成份外，再加：甘氨酸 3.00 克万古霉素 5.00 毫克多粘菌素B 10 万单位4.3 明胶酶试验培养基：此培养基的制备，除用明胶（每100ml 中加3g ）代替琼脂外，其它同BCYE α培养基。
4.4 酪氨酸BCYE α培养基：在BCYE α琼脂中除去碳粉，再于每升培养基中加0.45g 酪氨酸。
军团菌检验-金盛楠
根据WHO官方网站的数据，温度对军团菌生长的影响如下：
◆ Above 70 °C (158 °F) - 几乎立即死亡 ◆ At 60 °C (140 °F) - 90% 在2分钟内死亡 (Decimal reduction time (D) = 2) ◆ At 50 °C (122 °F) - 90% 在 80-124 分钟内死亡, 根据菌株不同而有所 区别 (Decimal reduction time (D) = 80-124) ◆ 48 to 50 °C (118 to 122 °F) – 能够生存，但不能繁殖 ◆ 32 to 42 °C (90 to 108 °F) – 理想生长温度 ◆ 25 to 45 °C (77 to 113 °F) – 生长温度范围 ◆ Below 20 °C (68 °F) – 能生存，处于休眠状态，即使在冰冻条件下
Etiologic agent
Legionella species
Legionella species
Attack rate*
< 5%
> 90%
Isolation of organism
Possible
Virtually never
Outcome
Hospitalization common Case-fatality rate: 5-30%**
流行病学特点
1、传染源 兼性厌氧保内寄生菌，广泛存在于自然界水源与人工管道水源中，
空调系统冷却塔、循环蓄水池等是军团菌的常住地。主要寄生在原核 生物细胞体内，如阿米巴。原核生物不但提供各种军团菌所需要的营 养成分，在环境不利的情况下也为军团菌提供了一个庇护的场所，也 是军团菌转移、迁徙与感染高等动物与人的载体。原虫被军团菌裂解 后大量的菌体被释放到水体、环境中，通过宾馆一些能产生气溶胶的 器件而被人体吸入感染。
军团菌及其检测方法
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
5
军团菌种
种名 Legionella pneumophila Legionella bozemanae Legionella dumoffii Legionella gormanii
发现时间
1979 1980 1980 1980
种名 Legionella maceachernii Legionella parisiensis Legionella rubrilucens Legionella santicrucis
第三类
B
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
20
Part III：军团菌的分离与检测
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
21
水样标本中军团菌的分离方法
检测依据:
《公共场所集中空调通风系统卫 生规范》中的集中空调通风系 统冷却水、冷凝水中嗜肺军团 菌的检验方法见附录B。 适用于各种环境标本军团菌检 测 ，包括： 饮用水、工业用 水、天然水以及一些如沉积物、 沉淀物、软泥等物质。
1993
1994 1996 1996 1999 2001 2001 2001 2001 2001 2003 2004
1983 1984 1984 1985 1985 1985 1985 1985
1989 1989 1990 1990 1991 1991 1991 1992
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。
• 在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用 吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子并夹住其一端，以防止
管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使
军团菌的分离培养与鉴定福建省疾病预防控制中心
1990
Legionella gresilensis
2001
Legionella cherrii
1985
Legionella adelaidensis
1991
Legionella rowbothamii
2001
Legionella erythra
运输包装分类
学名
中文名
大量活菌操作
动物感染实验
样本 检测
非感染性材料实验
A/B
UN 编号
Legionella pneumophila
嗜肺军团菌
第三类
BSL-2
ABSL-2
BSL-2
BSL-1
B
UN 3373
样本的采集和运输
〔一〕标本的种类 〔二〕标本的运输和相关生物平安要求
标本的种类
环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中别离到军团菌。
样品浓缩
离心 过滤
接种
酸处理 热处理
水样的正压膜过滤法
安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。
水样的离心
将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶中； 6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在15～25℃之间； 无菌操作去除上清； 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。
标本的运输和相关生物平安要求
在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3℃)贮藏在实验室或其他地方。 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20℃冻存备用。
军团菌的分离培养与鉴定
军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型 （serogroups)，至少有20个种可引起人感染。
军团菌种
种名 Legionella pneumophila
发现时间
1979
种名 Legionella maceachernii
发现时间
1985
种名 Legionella geestiana
1980
1980 1980 1980 1980 1982 1982 1983
Legionella parisiensis
Legionella rubrilucens Legionella santicrucis Legionella spiritensis Legionella steigerwaltii Legionella israelensis Legionella birminghamensis Legionella brunensis Legionella cincinnatiensis Legionella moravica Legionella quinlivanii
水样的正压膜过滤法
1. 安放滤膜；
2. 过滤；
3. 取膜；
4. 洗膜。
水样的离心
1. 将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶 中； 2. 6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在 15～25℃之间； 3. 无菌操作去除上清； 4. 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。
军团菌操作生物安全性
应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。
《可感染人类的高致病性病原微生物菌 （毒）种或样本运输管理规定》
军团菌细菌分离鉴定作业指导书
军团菌细菌分离鉴定作业指导书【方法】1、标本运送和保存：军团菌抵抗力较强，但仍需尽快送实验室，以防污染菌生长。
应避免反复冻融。
水样标本应尽可能快或最好2d内送到指定实验室，不必冷冻，但应避光和防止受热，室温下贮存不得超过15d。
收到水样后应尽快进行检测，尤其对于已知含有生物防腐剂的样品，最好采样当天检测。
2、形态观察革兰染色：幼龄菌为革兰阴性短小杆菌，培养数日后可见多形性和长丝状。
革兰染色还可见菌体有空泡。
鞭毛染色可见1—2根单鞭毛和侧鞭毛，无荚膜、无芽胞。
3、培养特性观察：将待检菌接种BCYE平板、F-G平板、血平板和巧克力（色）血平板上，须置37℃，2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养37天。
如果在48小时内出现菌落或在这些培养液上均生长，则不是军团菌，如果仅在BCYE或F-G平板上生长，另外两种平板上不生长，而且至少在72小时以后出现菌落，则可能是军团菌。
在BCYE平板上4—5天可形成针尖大小的菌落，继续培养数日后菌落直径可增大至4—5mm。
菌落灰白色、圆形、湿润、有光泽、边缘透明。
呈刻花玻璃样条纹为其特征。
菌落较为黏着，并有特有的酸臭味。
在紫外线可见表面呈现白色自发荧光。
在F-G平板上培养10天才见生长，并可产生棕色色素。
4、生化反应触酶、氧化酶、β-内酰胺酶及马尿酸水解实验均阳性，不分解糖类产酸、脲酶及硝酸盐还原实验阴性。
5、气相色谱显示军团菌的细胞脂肪酸组成，易与其他细菌区别。
6、血清学检查（1）微量凝集实验：首先将军团菌标准株接种于BCYE或其他专用培养液上，35℃2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养3—4天，用0.01mol/l、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔，沸水浴1小时杀菌。
2000rpm离心10分钟后弃去上清液。
用含0.5%福尔马林的磷酸盐缓冲液配成悬液，使其浓度在420nm波长，光径1cm时吸光度值为0.65，即为诊断菌液。
诊断菌液在用前加石炭酸复红液1ul。
军团菌检测方法
军团菌检测方法军团菌概况军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。
军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。
即与水有关的地方均可能存在军团菌。
军团菌传播、感染有以下特点：1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50%病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。
生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2%-5%CO2能促进部分菌株的生长。
军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。
军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。
菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。
目前军团菌分为64种血清型及42个种。
ISO11731水样中军团菌检测方案采样：一般用玻璃或聚乙烯等无菌容器采样。
如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。
水样应当天检测为佳。
样品富集：如果样品中军团菌的数目预计多于105cfu/L，直接取样涂布于GVPC平板上分离培养检测。
如果样品中军团菌的数目未知或较少时，一般采用滤膜法或离心法富集军团菌。
滤膜法：将水样以0.22μm滤膜过滤浓缩，然后加入5ml无菌水，超声波振动混匀3min后为浓缩样品。
离心法：将水样置于高速离心机中，6000g离心15min，(15℃-25℃)，弃去上清，然后加入2ml-10ml无菌水，混匀后为浓缩样品。
样品处理：将浓缩样品分三份，一份直接取样涂布于GVPC平板上分离培养。
一份酸处理：2ml浓缩液+2ml缓冲液(0.2mol/L的HCl 3.9ml+ 0.2mol/L的KCl 25ml,KOH溶液调pH2.0±0.2)，摇匀5±0.5min。
军团菌分离注意事项
军团菌分离注意事项军团菌是一类造成严重呼吸道感染的致病菌，对于分离和处理军团菌的工作，需要特别的注意和细心。
以下是对于军团菌分离的注意事项：1. 安全防护：军团菌分离工作需要在生物安全实验室进行，确保操作人员具备必要的安全防护意识和技能。
操作人员应穿戴防护服、手套、口罩和护目镜，避免直接接触军团菌，以防止交叉感染和意外事故发生。
2. 操作规范：对于军团菌的分离工作需要严格遵守操作规范，确保操作过程中无菌操作。
严禁在实验室内饮食、吸烟和喷嚏，避免菌液污染和环境污染。
3. 实验设备：在军团菌分离工作中，需要使用高质量的实验设备和试剂，确保实验条件和结果的准确性。
对于实验设备和试剂的选择和使用需要严格按照实验方案和要求进行，避免污染和误操作。
4. 样本采集：在进行军团菌分离工作之前，需要对样本进行采集和处理。
对于样本的采集需要严格按照操作规范进行，避免外界污染和样本损坏。
同时，对于采集的样本需要及时处理，避免样本存放时间过长导致污染和变质。
5. 分离增殖：在进行军团菌分离工作时，需要进行分离和增殖培养。
在培养过程中需要严格控制培养条件和培养时间，避免菌落数量过多或者过少影响后续的实验操作和结果判读。
6. 结果判读：对于军团菌分离后的结果，需要进行准确的判读和鉴定。
在判读和鉴定过程中需要参考相关文献和标准，确保分离结果的准确性和可靠性。
7. 废弃物处理：在军团菌分离工作结束后，需要对实验产生的废弃物进行正确的处置。
对于实验产生的废弃物需要进行消毒处理，确保废弃物不会对环境和人体造成危害。
总之，军团菌分离工作需要高度注意和细心操作，确保实验过程和结果的准确性和可靠性。
操作人员需要具备丰富的实验经验和严谨的工作态度，才能够完成军团菌分离工作并取得可靠的实验结果。
军团菌及其检测方法
武汉市疾病预防控制中心—. —微生物检验科
淋浴器
• 收集最初流出的水标本 • 如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的
未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将 该切口处置于接取标本容器的开口处
值得注意的是新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别可疑军团菌菌落的进一步鉴定bcye或其他培养基上传代培养革兰染色镜检生化鉴定pcr检测军团菌特异性基因片段免疫荧光的方法确定军团菌的种类bcye或其他培养基上传代培养1至少从每块gvpc平板上挑选出两个典型的军团菌菌落在bcye和bcyecys培养基上传代培养传代培养要在两种培养基上同时进行
武汉市疾病预防控制中心—. —微生物检验科
冷却塔
• 警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉 冷却塔的鼓风机。戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于 机器继续运行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门 的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。
• 在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用 吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子并夹住其一端，以防止 管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使 瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子，水开始流出， 取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出。
Legionella shakespearei
武汉市疾病预防控制中心—. —微生物检验科
发现时间
1985 1985 1985 1985 1985 1985 1986 1988 1989
1989 1989 1990 1990 1991 1991 1991