微生物的生长和纯培养

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一、直接计数法
1、显微计数法（血球计数板法） 原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格
，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其 中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数 。
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适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、 酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞， 因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在 油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。
10、涂片染色法
•应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。
•方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：
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每ml原菌液含菌数=
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视野中平均菌数×涂布面积/视野面积
×100 ×稀释倍数
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二、间接测定法
1、测定细胞的组分含量进行估算 （1）测定DNA的含量 （2）测定蛋白质的含量 （3）测定ATP的含量
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图中表示的是一个 细胞经过若干代分裂 后的情况。从图可见 ，每经过一个代时， 细胞数目就增加一倍 ，呈指数增加，因而 被称为指数生长，这 就是单细胞群体生长 的特征。
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以细菌为例介绍单细胞微生物群体生长规律 ，其结论也基本适用于酵母菌。
生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生 长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。
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5、菌丝长度测定法
该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。 方法：将真菌接种在固体培养基的平皿中央，定
时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个 平皿。 缺点：不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌落 的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响结 果，不能反映菌丝的总量。 也可用U型管培养法，该法方便不易污染，但通 气不良。
同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的 同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而 是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料 。
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获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、 培养基等。造成与正常细胞周期不同的周 期变化。
选择法：选择性过滤、梯度离心。物 理方法，随机选择，不影响细胞代谢。
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2、从培养基中的某营养物的消耗来估算 3、从菌体代谢产物来估算 4、从发酵液的黏度来估算 5、从发酵的放热量估算 6、从发酵液的酸碱度来估算
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测含氮量
蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮 是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知 微生物的浓度。
一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为 7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的 含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。
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一、单细胞微生物的群体生长曲线
• 单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群 体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的， • 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称 为世代，一个世代所需的时间就是代时，代时 也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时 也称为倍增时间。单位时间内繁殖的代数成为 生长速率。
特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出 芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死 活细胞。
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2、比浊法（比色发）
原理是在一定范围内，菌悬液中的细 胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比 ，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分 光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密 度，就可反应出菌液的浓度。
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6、细胞堆积体积测定法
方法：将细胞悬浮液装入毛细沉淀管内，离心， 根据堆积体积计算含菌量。
该法快速、简便，培养液中如有其他固体颗粒， 则误差较大。
也可以用有刻度的离心管离心，通过所得的沉淀 体积推算出细胞的质量。
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7、电子计数器法
方法：在计数器中放有电解质及两个电极，将电 极一端放入带微孔的小管，通电抽真空，使含 有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通过 小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变化 ，则每个细胞通过时均被记录下来。因样品的 体积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌体 的大小与电阻的大小成正比。
•特点：快速、简便；但易受干扰。
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3.平板菌落计数法
技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（ 15~20min完成操作），严格无菌操作；
注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品 混匀处理，倾注平板时的培养基温度；
适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂 上生长的微生物；
误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有 由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
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4、干重测定法
将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离 出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或 80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而 一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。
该法适合菌浓较高的样品。 如大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体
培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培 养物可得10~90mg干重的细胞。
该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液 ，对链状和丝状菌无效。
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8、液体稀释法
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9、薄膜过滤计数法
常用该法测定含菌量较少的空气和水中的 微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜 、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜 上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数， 可求出样品中所含菌数。
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含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量 、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用 于生长量的测定。
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第二节 微生物的生长规律
由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存 在着技术上的困难。
同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都 在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进 行同步分裂的细胞称为同步细胞。
微生物的生长和纯培养
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在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞 经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。
在微生物学中培养和发酵两个概念是相同。在 工业上大规模的进行微生物培养称为微生物 发酵。
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第一节 微生物生长测定
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。
（一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）