微生物生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章 微生物的生长及其控制1
获得同步生长的方法： 获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化化化化 物物化化
过过过 区区区区区区区区过 膜膜膜过
获得同步生长的方法主要有两类： 获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细 胞周期不同的周期变化。 胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 不影响细胞代谢。 不影响细胞代谢。
☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律， 论也基本适用于酵母菌。 论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
二、以数量变化对微生物生长情况进行测定 （一）直接法
将待测样品制成菌悬液，适当稀释， 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方 格网的计数室内，在显微镜下直接计数； 格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的 体积一定， 体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个 数； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 要点：菌悬液浓度应在 个细胞/毫升左右 毫升左右； 要点：菌悬液浓度应在108个细胞 毫升左右；
控制微生物生长繁殖的主要方法及原理
控制微生物生长繁殖的主要方法及原理微生物生长繁殖的控制方法有多种，包括物理方法、化学方法和生物方法。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
物理方法：1.温度控制：微生物对温度非常敏感，不同种类的微生物具有不同的生长温度范围。
控制温度可以通过调节环境的温度来限制微生物的生长。
低温可以抑制微生物的繁殖，高温则可以杀灭微生物。
常见的温度控制方法包括冷藏、煮沸和灭菌等。
2.辐射控制：辐射是一种能够杀灭或抑制微生物生长的物理方法。
常见的辐射包括紫外线辐射和电离辐射。
紫外线辐射可以杀死微生物的DNA，从而阻碍其繁殖。
电离辐射则可以破坏微生物的细胞结构，导致其死亡。
3.过滤控制：通过过滤物质可以去除微生物，从而控制其繁殖。
过滤方法通常使用微孔过滤器或高效过滤器。
这些过滤器可以筛除微生物和微小颗粒，从而阻止其传播和生长。
化学方法：1.抗生素：抗生素是一类可以杀灭或抑制微生物生长的化学物质。
抗生素可以通过破坏微生物的细胞壁或阻断其代谢途径来发挥作用。
常见的抗生素包括青霉素、四环素和氨基糖苷类等。
2.消毒剂：消毒剂是一种可以杀死微生物的化学物质。
常见的消毒剂包括酒精、漂白粉和过氧化氢等。
消毒剂可以破坏微生物的细胞结构、蛋白质和DNA，从而导致其死亡。
生物方法：1.优势菌抑制：通过增加有益细菌的数量来抑制有害细菌的繁殖，从而达到控制微生物生长的目的。
常见的方法包括接种好气菌、厌氧菌和益生菌等。
2.使用控制病原微生物的生物制剂：生物制剂是指通过培养和提取微生物、代谢产物或酶制备的一种特定的微生物产品。
这些制剂可以具有抗菌、抗病毒和抗真菌等特性，可以控制微生物的繁殖和传播。
总之，物理方法、化学方法和生物方法是目前常用的控制微生物生长繁殖的方法。
选择合适的方法取决于对微生物种类的了解以及具体的应用环境。
通过综合使用这些方法，可以有效地控制微生物的生长和传播，从而保护人类的健康和环境的安全。
第六章微生物的生长及其控制
t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1) t2 - t1
3.322(lgx2-lgx1)
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25
一些细菌的代时
菌名
培养基 培养温度 代时
E. coli（大肠杆菌） 肉汤
37℃ 17min
E. coli
牛奶
37
12.5
Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）
肉汤或牛奶 37
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
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40
（1）恒浊器 — 恒浊连续培养
Ø特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长 ，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺 复杂，烦琐。 Ø使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
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23
（二）指数期
1、特点： Ø 生长速率常数R最大，即代时最短; Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致; Ø酶系活跃，代谢最旺盛。
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x2
2、指数期中的的
三个重要参数
x1
t1
t2
u繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)
u生长速率常数R= u代时G=
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29
（三）稳定期
1、特点： （1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 （2）菌体产量达到了最高点。 （3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。 （4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢； （5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。
第六章微生物的生长及其控制
（2） 恒化器：
与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液 流速保持不变，并使微生物始终在低于最高 生长速率下进行生长繁殖的一种连贯培养装 置 在恒化器中，一方面菌体密度会随时间的增 长而增高，另一方面，限制因子的浓度会随 时间的增长而降低，（使菌体生长慢），两 者相互作用，会出现生长与流速相平衡，这 样，即可获得一定生长速率的均一菌体，又 可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定 菌体密度的菌体。
3、 防腐：（Antisepsis）
是指利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁 殖，从而达到防止食品等发生霉变的措施。
措施：
（1） 低温： （2） 缺氧： （3） 干燥： （4） 高渗： （5） 高酸度： （6） 防腐剂：
4、化疗：（Chemotheraph）
即化学治疗，它是利用对病原菌具有高度毒力，而对 宿主细胞无显著毒性的化学物质来抑制宿主体内病原 微生物的生长繁殖，借以达到治疗在目的。
连续培养的优缺点：
优点： A、高效，简化了装料、灭菌，出料、清洗等 程序。 B、产品质量较稳定。 C、自控，可利用各种仪表加以控制。 D、节约人力、动力、资源（水、汽等） 缺点： A、菌种易于退化 B、易遭杂菌污染。
第二节 影响微生物生长的主要因素
影响微生物生长的外界因素很多，除一些营养 条件外，还有许多物理条件，其中最重要的有 温度，PH、氧气等。 一、 温度： 微生物的生长T有宽窄，但总有最低生长T，最 适生长T，最高T。并称为生长温度三基点。 最低生长T：一般-5---10。C，极端为-30。C 最适生长T：嗜冷菌；中温菌；嗜热菌。 最高生长T：一般为80—95。C，极端为105— 300。C。
三、 影响加压灭菌效果的因素：
微生物的生长及其控制
生长曲线反映的是群体的生长规律，不是但个细胞的生长 规律。 掌握微生物是生长曲线在生产实践中具有重要意义。 如：医学进行G＋ 的鉴定，通常采用对数期的菌体，因为 这时G＋反应最典型；工业上生产食品酵母，要在稳定期
可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。
由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生 长的状况。只有群体生长在微生物的研究和应用中，才有 实际意义。 单细胞微生物的群体生长具有明显的规律，且受到外界环 境因素影响，所以可以通过控制外界的环境因素对微生物
是生长加以控制。
研究生长规律需要解决三个前提：
耐氧菌
厌氧菌 严格厌氧菌
四、营养物质
营养物质对微生物的生长速率影响很大，营养丰富则生长 快，繁殖迅速；反之则反。
第四节 微生物生长的控制
微生物的生长繁殖对外界环境产生好或坏的影响 对人类而言，微生物有其有益的一面，同时也存在着危害 人类的一面。 必须对环境中的有害微生物施加影响，控制其生长繁殖。 一般通过消毒、灭菌、防腐等手段达到消灭有害微生物的
o
o
最高温度oC 20
生存环境 常年低温环境，如 地球两极、海洋深 处 海洋、湖泊、土壤、 冷泉、冰箱等 广泛分布，人和动 植物体表面等
耐冷微生物
0-5
25-40（37） 45
中温微生物
5-15
20-35
45
嗜热微生物30Fra bibliotek50-60
70-80
温泉、堆肥、热水 器等环境中
均为古菌，热泉、 火山口等处
超嗜热微生 物
06第六章 微生物的生长及控制
1. 微生物生长繁殖的pH值
大多数细菌、放线菌喜欢生活在中性偏碱的环境中， 细菌最适的pH在7.0~8.0之间，放线菌的最适pH在7.5~8.5 之间； 而酵母菌和霉菌刚好相反，适合在偏酸的条件下生 长，霉菌的最适pH值在4.0~5.8之间，酵母菌在3.8~6.0之 间。
2. pH值对微生物生长的影响
稀释倒平板法
操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！
2. 膜过滤培养法
菌数低的样品（如水）→ 膜过滤 → 培养 → 菌落计数
3. 显微镜直接计数法
缺点：
① 不能区分死菌与活菌 ② 不适于对运动细菌的计数 ③ 需要相对高的细菌浓度 ④ 个体小的细菌在显微镜下难以观察
4. 比浊法
5. 重量法
为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？
氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧 离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过 氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过 程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化 物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由 基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧 气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能 合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。
将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净， 然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其 干重。一般来说，干重约为湿重的10~20%，即 1mg干菌 = 5~10mg湿菌 = 4~5×109个菌体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.氮量法(生理指标法)
微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以 常作为生长量的指标。如细菌含氮量约为菌体 干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白 质含量。
微生物7 微生物的生长及其控制
第七章 微生物的生长及其控制
z z z z z z
生长 (growth)：个体体积或重量的变化 繁殖 (reproduction)：个体数量的变化 个体生长→个体繁殖→群体生长 群体生长＝个体生长 ＋ 个体繁殖 生长和繁殖是交替进行的 衡量群体生长的量： 重量、体积、密度、浓度、个体数目等 生理指标：测含氮量、测含碳量、测磷、 DNA、RNA、ATP、呼吸
第一节 微生物生长的测定
测定生长量 测体积 称干（湿）重 比浊法 颜色改变单位 生理指标法：测含氮量 测含碳量 测磷、DNA、RNA、ATP 呼吸
微生物生长的测定
测细胞的个数
¾比例计数法 ¾血球计数法 ¾平板活菌计数法：
菌落形成单位 (cfu, colony forming unit） ¾膜过滤法 ¾稀释摇管法
比浊法
turbidity
血球计数法
z
又被称为Petroff-Hausser counting。
平板活菌计数法
平板活菌计数法的两种策略——涂布 和倾注
膜过滤法——用于较稀溶液的计数 方法
膜过滤法
硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法
由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3随后又逐渐转变为随机生长。
邻苯基苯酚
六氯酚
哈拉腙
十六烷基吡啶氯
氯苯甲烷铵
丙炔内酯Disinfectants and antiseptics。
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稳定期的实践意义
• 是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获
期；
• 某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在
此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段， 故又称作代谢产物合成期；
• 导致了连续培养原理的提出和工艺技术的
改进。
4）衰亡期 (decline phase,death phase)
• 特点：Байду номын сангаас• 细胞以指数速率死亡， 细胞死亡速率超过
2 活细胞计数法
1）平皿菌落 落计数法
2) 薄膜过滤平皿计数法
微生物生长测定方法比较
• 方法
特点与应用
测 定 细 胞 数
总 细 胞 数
血球计数板法 薄膜过滤染色法
较简便，但较费时 快速简便，适于含菌数很低的空气、水等中的总菌计数
目 活 平皿菌落计数法 简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果
第一节 微生物的生长
一、研究微生物生长的两个先决条件： 纯培养（pure culture）、 同步生长(synchronous culture)
1. 纯培养：从一个细胞或一种细胞群繁殖得
到的后代。
2. 同步生长：所有细胞处于生长的相同阶段，
都能同时分裂。
微生物纯培养的分离方法之一 稀释倒平板法分离微生物
t
0
lgN -lgN
t
0
lg2
0.301
式中N0为起始细胞数目，Nt为指数生长某个时刻t时 的细胞数目，n为世代数。N0、Nt和t可由实验获 得，n可通过上式计算得出。
• 世代：由1个细胞分裂成为2个细
胞的时间间隔被称为世代。
• 代时：细胞每分裂一次所需的时间，
也称世代时间或者增代时间。
2.微生物生长曲线
（分光光度计测OD值）。
• 4.生理指标法：消耗底物的量或产生的
物质量。
比浊法
活菌数（亿个/毫升）
2.5
2
1.5
1
0.5
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
OD值
图示 假单胞菌OD值和活菌数的关系
（二）微生物细胞数目 的检测方法
• 1 总细胞计数法
1） 血球计数板法
• 2） 比例计数法：细菌悬液与等体 积的血液混合涂片。
四、培养微生物的两种方式
• （一）分批培养和连续培养
1.分批培养（batch culture）就是指将微生物置于一 定容积的培养液中，经过培养生长，最后一次收获的培 养方式。 2.连续培养(continuous culture) 基本上说来就是在一 个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速 率不断地加入新的培养液，另一方面又以相同的速率流 出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞 数量和营养状态保持恒定，即处于稳态。
细
胞 数
薄膜过滤平皿法
灵敏度高, 不用于高密度培养物，不能立刻知道结果
测 细胞湿重法
较为简便，但含水量不定，准确度差
定 物
细胞干重法
较为费时，较准确，但易受颗粒杂质干扰
质 量
细胞成分含量法 如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等
比浊法
快速简便，敏感度低，适于发酵液或液体中的快速 总细胞计数，但需事先标定
3）稳定期(stationary phase)
• 特点： • 活细胞总数维持不变，细胞生长速率为零，
即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等
• 菌体总数达到最高点 • 芽孢杆菌此时开始形成芽孢，G+染色发生
变化。
• 初级代谢产物大量积累
为什么细胞总数不再增加？
• 营养物质被消耗不能满足生长需要 • 代谢废物或有害物质积累到抑制生长水平 • pH、氧化还原势等物化条件越来越不适应
获得同步生长的方法
• 1.选择法：
离心沉淀分离法、硝酸纤维素薄膜法、 过滤分离法
• 2.诱导法：
是采用物理、化学因子使微生物细胞生 长进行到某个阶段而停下来，使先期到达该 阶段的微生物细胞不能进入下一生长阶段， 待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除 去该因子，使全部群体细胞同时进入下一个 生长阶段，以达到诱导微生物细胞同步生长 的目的。
（二）连续培养类型
连续培养类型
• 恒浊连续培养：（内控制菌体密度）
可获得最高的生长速率，用于工业生产 以获得大量的菌体及其代谢产物。
• 恒化连续培养：（外控制流速）
可获得低于最高速率的生长速度，适于 实验室
（二）生长曲线
• 1.指数生长公式：
Nt= N0×2n
lgNt=lgN0+nlg2
n = = lgN -lgN
获得纯培养的方法
• 微生物纯培养的分离方法之二 • 稀释涂布法分离微生物
微生物纯培养的分离方法之三 平板划线法分离微生物
微生物纯培养的分离方法之四
• 单细胞挑取法：利用显微操作仪，
在显微镜下挑取一个单细胞进行培 养
微生物纯培养的分离方法之五
• 选择培养基分离法：菌悬液进行适
当稀释涂布于选择培养基上
选择法
三、微生物群体生长的测定方法
• 测定群体微生物细胞数目的增加 • 测定群体微生物细胞物质量的增加
（一）细胞量的测定
• 1. 干重法：将微生物菌体或离心得到
的细胞沉淀物置100—105℃的烘箱 中干燥至水份去除，直至恒重。
• 2. 氮量法：微量凯氏定氮法 • 3.比浊法：菌液的浓度与浑浊度成正比
• 接种龄: 对数期的“种子” ，延滞期较短；
延滞期或衰亡期的“种子”，延滞期较长
• 接种量： 接种量大，延滞期较短；
接种量小，延滞期较长
• 培养基成分:
培养基成分丰富的， 延滞期较短 培养基成分与种子培养基一致，延滞期较短
2）指数期(log phase)
• 指数期特点
a生长速率最快，细胞呈指数增长 b生长速率恒定 c代谢旺盛，酶系活跃 d群体的生理特性较一致
单位体积活细胞数对数 光密度
对数增长期
细菌停止生长
稳定期
浊度（光密度）
活菌计数
消亡期 活菌数减少
细菌分裂速率最高
迟缓期 无增长
时间
1）延滞期（lag phase） • 延滞期特点:
a生长速率等于零 b细胞合成新的成分，代谢活跃 c细胞形态变大或变长 d对外界不良环境敏感
影响延滞期长短的因素与实践意义
新生速率，群体呈负增长
影响指数期的因素
a菌种：不同菌种的代时差异极大； 选择对数期菌种、大量接种， 代时短
b营养成分：营养越丰富，代时越短 c营养物浓度：影响微生物的生长速率 和总生长量 d培养温度：影响微生物的生长速率
指数期的实践意义
• 是代谢、生理等科研的良好材料 • 是发酵生产中用作“种子”的最佳种
龄
• 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 • G+染色鉴定时采用此期微生物