DNA序列测定(精)
基因的序列分析 20131024
双脱氧核苷酸(ddNTP)
3’-5’磷酸 二酯键
不能与下一个脱氧 核苷酸结合!
（1）Sanger双脱氧末端终止法
背景知识
在PCR反应体系中，如果只加入一条引物是什么样子的结果？
• •
单引物只能扩增单链DNA 扩增的包含引物的单链DNA 不对称PCR (asymmetric PCR) 是用不等量的一对引物，PCR 扩增后产生大量的单链 DNA(SSDNA).
KRAS基因突变主要发生在密码子12，13上
密码子12/13发生变异的患者
应用 （举例说明： 应用焦磷酸测序法检测DNA甲基化）
焦磷酸测序法检测DNA甲基化
5’甲基胞嘧啶 在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶
焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点 焦磷酸测序技术可检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平
将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固
相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程， 基本流程如下：
①制备待测 DNA 样品、标记基因探针；
②电泳分离待测DNA样品； ③待测DNA样品的变性、转膜；
④杂交；
⑤显色。
Southern 印迹杂交
Southern印迹基本操作过程
两种特殊底物 APS, 荧光素 四种酶： • DNA聚合酶 • ATP硫酸化酶• 荧光素酶
• 三磷酸腺苷双磷酸酶
（3）焦磷酸测序法
原理
DNA聚合酶
APS+
硫酸化酶 荧光素酶
双磷酸酶
荧光素+
（3）焦磷酸测序法
测序原理
第一步：加入测序引物，相关酶，底物，和其他试剂 第二步：每次加入一种dNTP,如果结合，则会产生一个焦磷 酸（PPi） 第三步：硫酸化酶转化PPI为ATP, ATP使荧光素酶发出荧 光。（产生的荧光强度与结合的核苷酸成正比） 第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环。 看一下视频
放射性同位素标记的DNA序列测定分析(精)
放射性同位素标记的DNA序列测定分析测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。
从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。
目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。
Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。
它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。
其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。
通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。
一、试剂准备１．硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。
２．6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。
使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。
3.质粒DNA碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。
4.T7测序试剂盒。
二、操作步骤1.测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。
2.灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。
夹好，将测序板放水平。
聚合约3hr后预电泳。
3.预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。
pcr和dna测序
通过变性、退火和延伸等步骤，将DNA片段扩增数百万倍。
循环扩增
提高PCR的保真性，减少突变和错配。
使用高保真酶
优化引物设计
使用多重PCR
应用实时PCR技术
提高引物的特异性和扩增效率。
同时检测多个目标序列，提高检测效率。
实时监测PCR进程，提高定量准确性。
03
CHAPTER
dna测序技术
05
CHAPTER
pcr和dna测序在环境科学中的应用
利用pcr和dna测序技术，可以快速、准确地检测和鉴定环境中的物种，为生物多样性研究提供数据支持。
物种鉴定
通过分析环境中微生物的基因组序列，可以了解微生物群落的组成和功能，进而分析微生物群落对环境变化的响应和适应机制。
生态系统分析
通过对濒危物种的基因组测序，可以评估其濒危程度和遗传多样性，为保护濒危物种提供科学依据。
环境风险评估
06
CHAPTER
pcr和dna测序在其他领域的应用
PCR技术可用于鉴定个体身份，如亲子鉴定、犯罪嫌疑人确认等。
身份鉴定
利用PCR技术可检测微量的DNA证据，如唾液、血液、精液等，有助于确定犯罪行为。
痕迹鉴定
PCR可以用于检测毒物，如毒品、农药等，帮助确定犯罪手段和类型。
毒物分析
食品溯源
利用PCR技术可以快速检测食品中的病原菌，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保障消费者健康。
病原菌检测
毒素检测
利用PCR技术可以检测食品中的毒素，如黄曲霉素、亚硝酸盐等，确保食品的安全性。
利用PCR技术可以追踪食品的来源，有助于食品卫生监管和食品安全事件的调查。
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DNA鉴定方法
DNA鉴定方法DNA鉴定方法DNA鉴定是一种通过对DNA序列的比较分析，确定个体之间的亲缘关系或确认身份的方法。
DNA鉴定在刑侦、亲子鉴定、遗传病诊断等领域有广泛应用。
本文将介绍DNA鉴定的基本原理和常用方法。
DNA鉴定的原理在于人类DNA的独特性和遗传性。
DNA是一种包含遗传信息的分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们按照一定的规则排列成两条螺旋状的链。
每个人的DNA序列都是独一无二的，除了一些双胞胎之外。
鉴定方法主要利用DNA的这种独特性，通过比较个体的DNA序列，确定是否具有亲缘关系或是否为同一人。
常用的DNA鉴定方法包括：1. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：RFLP分析是DNA鉴定的经典方法之一。
它通过利用限制性内切酶将DNA切割成多个不同长度的片段，然后使用凝胶电泳将这些片段进行分离，并利用射入探针的杂交方法进行检测。
不同个体之间的DNA序列差异会导致不同的片段长度，从而可以通过比较片段长度来确定个体之间的亲缘关系。
2. PCR（聚合酶链式反应）分析：PCR是一种快速有效的DNA复制技术，可以从微量DNA中扩增出足够数量的DNA片段用于分析。
PCR分析常用于亲子鉴定、法医学和遗传病诊断。
PCR分析通常配合其他技术如序列分析、飞行时间质谱和DNA芯片等来进行。
3. STR（短串联重复）分析：STR分析是目前最常用的DNA 鉴定方法之一。
STR序列是由2-6个碱基重复单元组成的，不同个体之间的STR序列重复单元数目存在差异。
STR分析通过PCR扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分离，并通过比较STR重复单元数目来鉴定个体之间的亲缘关系或身份。
DNA鉴定的过程包括取样、提取DNA、扩增DNA片段、分离和检测。
取样可以采用血液、口腔拭子、毛发等样品。
提取DNA需要将样品中的DNA从细胞核和细胞器中分离出来。
DNA扩增通过PCR技术，可以在短时间内从微量DNA样品中复制出大量DNA片段。
DNA测序技术简介
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性
B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
5ˊP 3ˊHO 制备单链DNA 5ˊP
OH 3ˊ P 5ˊ OH 3ˊ
加放射性引物
1978]惟及从嗜热水生菌（T'hermus aquaticus）分离的耐热DNA聚合物
（Taq DNA聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过 链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。
４．放射性标记的dNTP 直至几年以前，实际上所有DNA测序反应都用[α－32P]dNTP来进 行。然而32P发射的强β粒子造成两个问题。 首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA 条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从放射自 显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上能读出 的核苷酸序列的长度。其次32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解， 因此用32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNA将被严重 破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。 [35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大缓解了上述两方面的矛 盾。由于35S衰变产生较弱的β粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自 显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数 百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较 轻微，因此，测序反应可在－20℃保存至1周，而分辨率不见下降。 这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要对测序反应进 行重分析即可。
２．模板 有两类DNA可以用作Sanger 法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性 或碱变性的双链DNA。 采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA应中获得数百个 核苷酸的序列。如用变性双链DNA用模板，则较难获得高质量的结果。尽管
DNA片段序列测定的策略
原理：将待测 DNA 克 隆于噬菌体载体（M13） 上，然后通过一定手 段将待测 DNA 片断化 （DNA 片断化的手段 通常有超声波处理和 酶切），得到两端彼 此重叠的部位不同的 若干小片段，再测出 每一片段的序列，将 各片段的序列依次排 列，即能得出总的序 列。
鸟枪法原理示意图
大致步骤： 1.超声波处理：将DNA随机断裂 成一组相互重叠的300-900bp片 段，电泳回收300-600bp片断作 亚克隆 2.DNaseI切割：将DNA随机切割 成一组相互重叠的片段，作亚 克隆 3.限制酶消化：限制酶将DNA切 割为含粘端的DNA片段，作亚克 隆将上述含不同子片段的亚克 隆扩增后进行测序
DNA片段序列测定的策略
主 讲：刘天星 小组成员：孙凯 李幸
2012-6-7
1
一、DNA测序 二、主要测序策略
三、未来测序技术
一、DNA测序
DNA测序：对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成 DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。主要方法有桑格-库森法。 原理：在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、 T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单 链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不 同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自 显影，可直接读出DNA的序列。
1、鸟枪法 2、缺失克隆法 3、引物步移 4、通用引物指导未知序列的测定
1、鸟枪法
鸟枪法（随机克隆测序）：将待测序列。当这些末端序列的数量达到一 定程度后，性党羽待测DNA片段的每一部位的序列也就 都被测定出来了。通过这些多测序列之间的重叠部分， 最终可将整个DNA片段的额序列拼接出来。 鸟枪法的优点是速度快，简单易行，成本较低。但用 它来测序，最终排序结果的拼接组装不太容易。
DNA序列分析
第七章 DNA序列分析DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物学含义，首先必须知道其DNA 顺序。
因此DNA序列分析(DNA sequencing)是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。
1986年由美国学者提出的，目前正在实施的人类基因组计划(human genome project)，则是要通过对人类基因组3×109bp全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构，认识其功能，即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。
核酸的核苷酸序列测定方法已经过近20年的发展，因而测序的具体方法五花八门、种类繁多。
但是究其所依据的基本原理，不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。
虽然原理不同，但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上。
由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。
然后在可以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
以下分别介绍。
1、Sanger的双脱氧链终止法这是1977年由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger（桑格）等人发明的，是一种简单快速的DNA序列分析法，利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列。
它的基本原理是：利用DNA聚合酶的两种酶促反应的能力。
第一是，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，准确地催化合成出DNA互补链。
实际上这是DNA在体外进行的复制过程。
第二是，DNA聚合酶能够利用2′，3′-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链（由几个核苷酸组成的核苷酸链叫做寡核苷酸链）的3′末端，从而终止DNA链的生长。
DNA测序技术
板凝胶电泳分离速度提高了25 倍, 但一只毛细管只能分离一 个样品,因此分析效率幵未提 高。为了提高分析效率,1992 年美国的M athies 等首先提出 阵列毛细管电泳新方法, 采用 激光聚焦荧光扫描检测装置, 25 只毛细管幵列电泳, 每只毛 细管在115小时内可读出 350bp ,DNA 序列分析效率可 达到6000bp／ h。
*
*1.用于亲子鉴定、司法机关等鉴
定类
*2.用于疾病的抑制和细菌的传播，
提高诊疗效率等预防类
*3.用于器官移植以减少器官排斥 *4.最新研究迚展
*
* 鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴
定。一个人有23对（46条）染色体，同一对 染色体同一位置上的一对基因称为等位基因， 一般一个来自父亲，一个来自母亲。如果检 测到某个DNA位点的等位基因，一个与母亲 相同，另一个就应与父亲相同，否则就存在 疑问了。 利用DNA迚行亲子鉴定，只要作十几至 几十个DNA位点作检测，如果全部一样，就 可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不 同，则可排除亲子关系，有一两个位点不同， 则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的 检测迚行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关 系的准确率几近100%，肯定亲子关系的准确 率可达到99.99%。
*Sanger法测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待
定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸 为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成， 每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)， 幵混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的 寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点 由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和 ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几 百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始 点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可 用X-光胶片放射自显影或非同位素标记迚行检测。
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未知DNA序列互补的引物。M13噬菌体重组子的通用测序引物一
般长15-29bp。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双 链”测序，并且已经商品化。
（三） Sanger双脱氧链终止法的原理
在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链 上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入 不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的
5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，
（一）序列分析的目的，2种： 1、确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时比 较野生型基因上同源区和测定的突变体的相应序列的差异。（已知 基因序列） 2、从头序列 目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未 知基因序列） （二）测定在生物、医学领域相应应用，2个方面： 1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关 基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。 2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级 结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸 的排列顺序。
第六节
DNA序列测定
一、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年 代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测 定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学 裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列 测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过 核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。
植物材料：样品处理，液氮 2、试剂：
细胞提取液：NaCL, Tris-HCL, EDTA,SDS，KCL，β-巯基乙醇，
65 ℃水浴，20min 离心：4 ℃，5 000 rpm ,10min RNase: 37℃ ,30min 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。注 意
四、测序的常用方法
DNA序列测定常用方法有如下 3 种： 1、末端终止法 使用特异性引物与单 链模板DNA退火， 在DNA聚合酶作用 下进行延伸反应，用 ddNTP终止，用 PAGE区分长度仅相 差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成测 序的方法。
优点
2、化学裂解法
3、DNA测序自动化
用化学试剂在A、G、 类似末端终止法，所不 C、T处特定的裂解 同的是用荧光染料标记， DNA片段，产生一簇 计算机自动读出。 各种长度的短链，经 过PAGE放射自显影可 直读DNA顺序。
简便、迅速、应用广 不需酶促反应，可以 泛。 对寡核苷酸测序。
1、高负荷，1块胶可测 16个样品；2、机读不 需放射自显影；3、安 全不用同位素；4、简 单迅速。
五、测序的基本过程
不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1、制备待测DNA序列模板； 2、酶促或化学反应将其转变“等差数列” （n=1）
直接读出DNA的核苷酸序列。
二、试
（一）引物
剂
酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷
酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载
体，以取得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双
链DNA模板序列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用 能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与
二、DNA序列测定工作原理
在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同 位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一 系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为
一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列
相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影， 可直接读出DNA的序列。
三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）
第五节 DNA的提取
一、DNA的提取
1、材料：动物、植物、微生物 2、试剂：
组织匀浆液：NaCL, Tris-HCL, EDTA, 低温
离心：4 ℃，5 000 rpm ,1min 裂解液： NaCL, Tris-HCL, EDTA，蛋白酶K,55℃,过夜 RNase: 37℃ ,1h 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) DNA水相，例外情况 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支 持胶）。 注意事项
基因定点诱变的基础
基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础
确定DNA序列中蛋白质的编码区
方法一
Sanger双脱氧末端终止法
一、原 理
（一）DNA复制的4个基本条件 1、ssDNA模板 2、ddNTP 3、带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物 4、4种dNTP （二）链终止剂（chain-reminator）----2，3-二脱氧核糖核酸酶 当3’-OH由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成3’， 5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相 同的4组引物-模板混合物，每一组加4种dNTP，其中1种用32P（或35S） 标记，加1种ddNTP，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同 长度的核苷酸链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序（dNTP 和ddNTP竞争）。
3、PAGE
4、读序六、测序技术的最近发展 Nhomakorabea1、商品化测序试剂盒 决了质粒问题，节省了时间，
但缺乏灵活性。
2、自动化测序仪 3、热循环测序 4、测序商品化 以酶学测序反应或（和）放标测 使极少数测序产物线性放大。 60.-180.￥，搞定。
序产物为基础，微机处理。
七、DNA序列测定的应用
分析基因组核苷酸排列序列 分析基因序列