放射性同位素标记的DNA序列测定分析(精)
【生物】同位素标记法应用例析（二）
【生物】同位素标记法应用例析（二）同位素示踪法是生物学实验中经常应用的一项重要方法，它能让我们更好地理解不同生理过程中物质变化与转移的途径。
同位素示踪法在《遗传与进化》中也有广泛应用，主要分布在DNA是主要的遗传物质、DNA的分子结构、DNA复制、基因指导蛋白质的合成、基因工程等部分。
现结合《遗传与进化》内容，就放射性同位素的应用原理及例析归纳如下：1.证明DNA是遗传物质原理：在研究蛋白质和DNA在遗传中的作用时，分别放射性标记蛋白质和DNA的特征元素（指蛋白质有的而DNA没有的元素，或者是DNA有的而蛋白质没有的元素，如蛋白质的特征元素是S，而DNA 的特征元素是P），通过培养、离心等一系列手段，根据上清液或沉淀物中的放射性来“区别”观察这两种物质在进入细胞并产生子代中的作用。
2.探究DNA分子半保留复制的特点（1）DNA分子复制n次后，计算子代DNA分子数、子代DNA 分子的脱氧核苷酸链数原理：DNA分子在自我复制过程中，最鲜明的特点就是半保留复制。
一个DNA分子无论复制多少代，这个DNA分子的两条链不变，一直作为模板，分别进入两个子代DNA分子中。
已知某全部N原子被15N标记的DNA分子（0代），转移到含14N的培养基中培养（复制）若干代后，其DNA分子数、脱氧核苷酸链数及相关比例见下表：原理：通过放射性标记来“区别”亲代与子代的DNA，如放射性标记15N，因为放射性物质15N的原子量和14N的原子量不同，因此DNA的相对分子质量不同。
两链都是15N的DNA，离心时为重带；一链是15N、一链是14N的DNA，离心时为中带；两链都是14N的DNA，离心时为轻带。
根据重带、中带、轻带DNA出现的比例可判断DNA复制是全保留复制还是半保留复制。
3.探究基因的转录和翻译原理：用放射性同位素标记尿嘧啶核糖核苷酸（RNA的特征碱基为U）、氨基酸，则在基因转录、翻译的产物中就会含有放射性同位素，还可以用来确定转录、翻译的场所。
DNA探针检测特定序列存在性与参杂情况
DNA探针检测特定序列存在性与参杂情况介绍DNA探针是一种经典的分子生物学技术，用于检测DNA序列的存在性和参杂情况。
该技术在医学、农业、法医学等领域中得到广泛应用。
本文将讨论DNA探针检测特定序列的原理、方法和应用。
一、原理DNA探针是标记了荧光染料或放射性同位素的DNA片段。
根据碱基互补配对规则，探针可以与目标DNA序列的互补序列进行特异性的杂交。
通过检测探针与目标DNA序列结合后的信号，可以判断目标DNA序列的存在性和参杂情况。
二、方法1. 制备DNA探针：首先，需要合成与目标DNA序列互补的DNA片段，并进行标记。
标记可以使用荧光染料、放射性同位素或其他显色剂。
接下来，可以通过PCR方法扩增标记的DNA片段，以获得足够数量的探针。
2. 杂交实验：将标记的DNA探针和待检测的DNA样本混合，并进行杂交反应。
通常，反应体系中包含盐，酶和缓冲液，以优化杂交反应的条件。
通过温度控制和时间控制，控制探针与目标DNA的杂交反应。
3. 洗涤和检测：在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除非特异性结合的探针。
然后，使用荧光显微镜或其他检测方法来观察目标DNA序列的存在情况。
荧光显微镜可以通过荧光信号的强度和位置来确定目标DNA的存在性和参杂情况。
三、应用1. 医学诊断：DNA探针技术可以检测某些遗传病的突变位点，从而进行早期诊断和基因治疗。
例如，使用DNA探针可以检测BRCA基因的突变，以判断一个人是否患有乳腺癌或卵巢癌的风险。
2. 基因工程：在基因工程中，DNA探针可以用于筛选转基因生物，以确定是否成功地将目标基因导入到宿主细胞中。
这有助于提高基因工程的效率和准确性。
3. 物种鉴定：DNA探针还可以用于物种鉴定。
通过检测特定的DNA序列，可以确定目标物种的存在性和参杂情况。
这在动植物保护和环境监测中有着重要的应用价值。
4. 法医学：DNA探针技术在法医学中广泛应用于犯罪现场的DNA分析。
通过检测痕量DNA的特定序列，可以确定嫌疑人的存在和参与犯罪的可能性。
第四讲 放射性同位素标记物
二、化学合成法：化学合成制备标记化合物最主要的 方法，此法基于化学合成反应的原理，利用简单的放射 性化合物作原料来制备所需的标记化合物．原则上凡能 用化学合成法合成的化合物，均可用化学合成法制备标 记化合物，其机理和方法与一般化合物合成没有本质区 别。然而，毕竟制备的是放射性核素标记物，且在标记 位臵、活度、放化纯度等方面有特殊要求，因而与普通 化学合成又有许多不同处． 首先，在选用原料方面，制备标记化合物的起始原料大 多只能用简单的无机物 ； 其次，在选择合成路线时，要根据所需要的标记位臵专 门设计，力求使标记原子在分子中较稳定的位臵或特定 的位臵上，并需考虑如何使放射性得率最高 ； 另外，制备高比活度的标记化合物，需采用微量合成及 分离纯化技术，一般需设计专门的微量合成装臵，尽量 采用低温、真空技术和避免高温、高压等剧烈反应，以 减少放射性沾污 。
非定位标记(Non—specific labeling)：又可分为均匀标记 (Uniform labeling)和全标记(General labeling)． 均匀标记是指放射性原子均匀地分布淤分子中，如用 14C0 通过植物光合作用制得的14C－葡萄糖，其分子中 2 六个碳原子从统计学上看，被均匀地标记上14C，故可 写成14C－萄萄糖(u)，或u-14C－葡萄糖． 全标记则既非均匀标记，又非定位标记，如用同位素交 换法制备氚标记化合物，往往标记物分子中所有氢原子 都可被取代，但几率各不相同，则用符号G来表示，如G －3H－胆固醇(或3H－胆固醇(G)）． 非定位标记化合物不能用于观察分子上特定基团或原子 的去向，而只是代表整个分子的代谢、分布等状况。非 定位标记可以得到较高的比活度．因为在一个分子中， 可能存在几个标记原子，且制备方法的选用面也较宽．
第四讲 放射性同位素 标记化合物
同位素技术生物医学研究及放射性示踪分析应用
同位素技术生物医学研究及放射性示踪分析应用随着科学技术的不断发展和进步，同位素技术在生物医学研究中发挥着重要的作用。
同位素技术通过引入放射性同位素标记分子，可实现对生物体内许多生命过程的研究与分析。
本文将重点探讨同位素技术在生物医学中的应用，并介绍放射性示踪分析在疾病诊断和治疗中的潜力。
同位素技术是一种通过标记分子中的某些原子核而实现对生物体内过程的研究和促进的方法。
生物体内过程，如代谢、分子交换、药物传递等，通常会涉及原子或分子的转移或转换。
通过引入具有放射性同位素的标记分子，可以实现对这些过程的观察和分析，为科学家提供了丰富的研究数据。
此外，同位素技术还能在生物医学检测、治疗和药物研究中发挥重要作用。
同位素技术在生物医学研究中主要有两种应用方式：代谢标记和示踪分析。
代谢标记是将稳定同位素或放射性同位素引入特定分子中，以追踪该分子在生物体内的代谢轨迹。
这种方法可以揭示生物体内代谢途径、鉴定代谢产物及副产物，并对药物吸收、分布、代谢和排泄等问题进行研究。
通过同位素标记的药物研发，科学家能够更好地了解药物在人体内的行为，为定制个性化的治疗方案提供基础。
另一种应用方式是放射性示踪分析，它集中在使用放射性示踪剂来标记具有特殊功能的生物分子。
放射性示踪剂通常是与生物分子相结合的放射性同位素，如碘-131、碘-123或碘-124等。
这些示踪剂在生物体内发生核衰变，通过放射线的发射可以实时地追踪分子的转移和相互作用，为疾病的诊断和治疗提供了重要的信息。
在生物医学研究中，同位素技术的应用已经取得了一系列重大突破和成果。
例如，同位素技术可以帮助科学家了解肿瘤的生长和扩散过程。
通过标记肿瘤细胞，同位素技术可以提供关于细胞增殖速率、瘤内血供和药物吸收等方面的信息。
这些信息对于肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。
同样地，同位素技术可以用于研究心脏功能、神经递质在神经系统中的分布与转运、肾功能和消化过程等生物学过程。
此外，同位素技术还被广泛应用于药物研发和检测领域。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
2021高考生物一轮复习第6单元遗传的分子基础实验微课5聚焦“同位素标记法”教案
[实验微课5] 聚焦“同位素标记法”1.相关原理同位素标记法是利用放射性同位素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法,生物学上经常使用的同位素是组成原生质的主要元素,即H、N、C、S、P和O等的同位素,正确选取上述相关元素用同位素加以标记,让它们一起运动、迁移,再用放射性探测仪器进行追踪,就可知道放射性原子通过什么路径、运动到哪里以及分布如何。
2.实例分析研究方向标记元素或物质结果分析分泌蛋白的合成和分泌一次性给予3H标记的某一氨基酸如亮氨酸放射性不同时间依次出现的细胞结构:核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜光合作用中某些物质的变化过程18O标记水(H218O) 生成的氧气(18O2)全部有放射性18O标记二氧化碳(C18O2)生成的葡萄糖(C6H1218O6)、部分水(H218O)有放射性,氧气(O2)无放射性18O、14C标记二氧化碳(14C18O2)生成的三碳化合物(14C3)、葡萄糖(14C6H1218O6)、水(H218O)均有放射性细胞呼吸过程中某些物质的变化过程18O标记氧气(18O2)生成的水(H218O)均有放射性,二氧化碳(CO2)均无放射性,即18O2→H218O18O标记葡萄糖(C6H1218O6)生成的水(H2O)均无放射性,生成的二氧化碳(C18O2)均有放射性,即C6H1218O6→C18O2有丝分裂过程3H标记胸腺嘧啶确定DNA合成期的起始点和持续时间32P和35S分别标记核苷酸和氨基酸确定分裂间期DNA复制、蛋白质合成噬菌体侵染细菌的实验35S和32P分别标记噬菌体的蛋白质外壳和DNA根据上清液或沉淀物中的放射性来“区别”蛋白质、DNA在进入细胞并产生子代中的作用DNA复制方式15N标记DNA双链(原料为14N) 复制1次后离心,均为中带(15N/14N)为半保留复制;1/2重带(15N/15N)、1/2轻带(14N/14N)为全保留复制基因的转录和翻译标记尿嘧啶核糖核苷酸(RNA的特征碱基依据放射性位置确定转录、翻译的场所为U)、氨基酸1.(2019黑龙江哈尔滨月考)为了研究酵母菌细胞内蛋白质的合成,研究人员在其培养基中添加3H标记的亮氨酸后,测得与合成和分泌乳蛋白相关的一些细胞器上放射性强度的变化曲线如图甲,有关的生物膜面积变化如图乙,其相关结构关系如图丙,则下列有关说法不正确的是( )A.图甲中a、b、c依次为核糖体、内质网和高尔基体B.图乙中d曲线表示的细胞结构是内质网,f曲线是高尔基体C.图丙中用3H标记的亮氨酸做原料,所以研究方法是荧光标记法D.能在图丙中④上观察到3H标记表明可能有分泌蛋白合成1.答案 C 甲图中a曲线所指的细胞结构是核糖体,b曲线所指的细胞结构是内质网,c曲线所指的细胞结构是高尔基体,A正确;图乙中d曲线的膜面积减少,故表示的细胞结构是内质网,f曲线的膜面积先增大后减小,故表示高尔基体,B正确;图丙中用3H标记的亮氨酸做原料,所以研究方法是放射性同位素标记法,C错误;高尔基体与动物细胞分泌蛋白的合成有关,氨基酸是蛋白质合成的原料,因此在图丙中④上观察到3H标记的亮氨酸,表明可能有分泌蛋白合成,D正确。
放射性同位素标记法课件
放射性同位素标记法可以通过两种方式进行，即直接标记法和间接标记法。直接 标记法是将放射性同位素直接与目标分子结合，而间接标记法则使用一种能与目 标分子结合的载体，将放射性同位素携带至目标分子上。
03
放射性同位素标记法的实验技 术
实验前的准备
选择同位素
根据实验需求选择适当的 放射性同位素，确保其具 有足够的半衰期和适当的 能量。
特点
具有灵敏度高、追踪目标明确、 操作简便等优点，广泛应用于生 物学、医学、环境科学等领域。
放射性同位素标记法的应用领域
01
02
03
生物学研究
用于研究生物体内物质的 代谢、运输、排泄等过程 ，如示踪剂追踪药物在体 内的代谢过程。
医学诊断
用于检测疾病的发生、发 展过程，如利用放射性同 位素标记的肿瘤标志物进 行肿瘤诊断。
放射性
放射性同位素会释放出射线，如α射线、β射线、γ射线等。 这些射线具有穿透能力和电离能力，可用于检测和测量。
半衰期
放射性同位素的半衰期是指该核素发生衰变时一半原子核发 生衰变所需要的时间。不同核素的半衰期不同，有的长有的 短。
放射性同位素标记法的原理
同位素标记法原理
通过使用放射性同位素标记某一特定原子或分子，可以追踪其在生物体内的分布 、代谢和排泄等过程。由于放射性同位素可以释放出射线，通过检测这些射线可 以追踪标记物的位置和数量变化。
环境监测
用于监测环境污染物的迁 移转化过程，如示踪剂追 踪水体中污染物的扩散。
放射性同位素标记法的历史与发展
历史
放射性同位素标记法最早由美国化学家赫维西于1923年提出，经过多年的发展 ，已经成为一种成熟的实验技术。
发展
随着科技的不断进步，放射性同位素标记法也在不断改进和完善，如新型示踪 剂的研发、高灵敏度检测设备的出现等，使得该方法的应用范围更加广泛。
DNA序列分析
第七章 DNA序列分析DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物学含义，首先必须知道其DNA 顺序。
因此DNA序列分析(DNA sequencing)是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。
1986年由美国学者提出的，目前正在实施的人类基因组计划(human genome project)，则是要通过对人类基因组3×109bp全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构，认识其功能，即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。
核酸的核苷酸序列测定方法已经过近20年的发展，因而测序的具体方法五花八门、种类繁多。
但是究其所依据的基本原理，不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。
虽然原理不同，但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上。
由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。
然后在可以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
以下分别介绍。
1、Sanger的双脱氧链终止法这是1977年由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger（桑格）等人发明的，是一种简单快速的DNA序列分析法，利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列。
它的基本原理是：利用DNA聚合酶的两种酶促反应的能力。
第一是，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，准确地催化合成出DNA互补链。
实际上这是DNA在体外进行的复制过程。
第二是，DNA聚合酶能够利用2′，3′-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链（由几个核苷酸组成的核苷酸链叫做寡核苷酸链）的3′末端，从而终止DNA链的生长。
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放射性同位素标记的DNA序列测定分析
测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。
从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。
目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。
Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。
它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。
其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。
通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。
一、试剂准备
１．硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。
２．6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。
使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。
3.质粒DNA碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH
4.8），无水乙醇，70%乙醇。
4.T7测序试剂盒。
二、操作步骤
1.测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。
2.灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。
夹好，将测序板放水平。
聚合约3hr后预电泳。
3.预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。
设置温度50℃，功率100W，时间约30min。
（同时准备测序反应）
4.质粒DNA双链碱变性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中，加2N NaOH 8μl，混匀，室温静置15min。
加3M NaAc 7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。
离心12000g×15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。
弃上清，晾干沉淀，10μl 灭菌ddH2O溶解。
5.模板与引物复性：加2μl测序引物、2μl Annealing buffer，混匀，稍稍离心，65℃温育 5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。
6.标记反应：加 3μl labeling mixture 、1μl相应放射性同位素（10μCi）、2μl T7测序酶（使用前以稀释液1∶5稀释），混匀，离心，置37℃5min。
7.预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。
8.链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃ 5min。
加入stop solution 5μl，短暂离心。
9.上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。
将四个反应管置80℃ 2min。
立即取1.5-2μl加到加样孔上。
10．电泳: 50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。
11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。
拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。
裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。
12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时间。
在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。
13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。
经D72显影、酸性定影液定影，水洗, 晾干。
在X 光片灯上读出序列。
三、注意事项
1.测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。
处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。
2. 灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。
3. 测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。
4. 规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。
手工测序需要使用同位素，这给操作带来许多不便，对操作者也有一定的损害。
DNA测序仪的出现解决了这一问题，它不使用同位素标记，自动化程度高，测序效果好。
虽然DNA 测序仪的价格目前仍比较高，但每次测序的花费并不算高，而且商品化服务也令人满意。