壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究

东南大学学报(医学版)J SoutheastUniv (Med Sci Edi)　2007,Jan;26(1):426 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30028012,30330530,30425009);教育部基金资助项目(TRAP OY199028418,SRF DP20030284040)。

[作者简介]张昊(1981-),女,江苏苏州人,理学硕士。

E 2mail:zhangh6666@yahoo [通讯作者]华子春　E 2mail:zchua@nju .edu .cn壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究张昊1,李淑锋1,2,陈允梓1,舒娈1,华子春1(1.南京大学医药生物技术国家重点实验室,江苏南京　210093;2.东南大学基础医学院,江苏南京　210009)[摘要]目的:研究壳聚糖纳米颗粒在体外和体内实验中的转染能力。

方法:用亚硝酸钠降解壳聚糖的方法制得低分子质量壳聚糖,用zeta 电位仪测定粒径、多分散度、zeta 电位,并使用乌式黏度计法测定其相对分子质量;通过静电吸附复合绿色荧光蛋白表达质粒p I RES 2eGFP (报告基因),采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA 结合能力;用体外和体内基因转染实验,评价纳米颗粒的转染能力。

结果:制得的壳聚糖粒径200～600n m,多分散度最好的达到01005,zeta 电位0189mV,相对分子质量717×107,粒径250n m 。

体外对3T3细胞的转染实验显示,该壳聚糖具有一定的转染效率;体内对Balbc57/BL6小鼠的股四头肌肌肉的转染实验显示,肌肉组织中有大量绿色荧光蛋白的表达,并且在炎症部位尤为明显。

结论:本研究制备的壳聚糖,能够在体外和体内均实现有效转染,为基因治疗提供了一种潜在的载体。

[关键词]壳聚糖;基因治疗;细胞转染;载体[中图分类号]Q782 [文献标识码]A [文章编号]167126264(2007)0120004203 基因治疗的应用之一就是在体内由DNA 直接产生相应的、有治疗作用的蛋白质。

基因治疗可以通过控制细胞周期蛋白质或者细胞因子等蛋白质的表达,用于肿瘤和免疫性疾病等许多获得性疾病的治疗[122]。

壳聚糖是一种氨基多糖,由几丁质经脱乙酰化后得到。

几丁质是海洋产业的副产品,所以产量丰富。

尤为重要的是,它具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性。

因此,它正作为一种继磷酸钙、脂质体之后的新型非病毒载体,被人们广泛关注[324]。

壳聚糖等电点偏碱性,在生理条件下,带正电荷的壳聚糖可与带负电荷的质粒通过静电作用,形成复合物。

低分子质量壳聚糖(l ow molecular weight chit osan,L MWC )比高分子壳聚糖(high molecular weight chit osan,H MWC )具有更加优良的载体性能[5]。

我们采用亚硝酸钠法[6],从高分子质量壳聚糖制备了低分子质量壳聚糖。

本研究探讨壳聚糖作为非病毒载体在体外和体内的转染效果,为其在基因治疗中的应用作了有益的探索。

1　材料与方法1.1　材料质粒I RES 2eGFP 和宿主菌E .coli Top10由本实验室保存,DME M 培养基,新生小牛血清为Hycl one 公司产品,脂质体转染试剂盒(L i pofect AM I N E )购自GI B CO 公司,壳聚糖购自青岛海普生物技术有限公司,3T3细胞株来自N I H,小鼠为Balbc57/BL6由南京大学模式动物中心提供。

荧光倒置显微镜为ZE I SS 公司的axi op lan2,zeta 电位仪为B r ookhaven I nstruments Cor po 2rati on 公司提供的90Plus Particle Size Analyzer 。

1.2　方法1.2.1　Na NO 2法降解壳聚糖　称取215g 壳聚糖,慢慢加入到250m l 015%乙酸溶液中,保持室温搅拌,壳聚糖被浸润成棉絮状。

称取75mg Na NO 2,加入到壳聚糖溶液中,不断搅拌,溶液黏度明显下降。

分别在30、60、90、120m in 后,取出50m l 溶液,分别标记为A 、B 、C 、D 。

使用zeta 电位仪测定A 、B 、C 、D 4份样品的颗粒大小和zeta 电位值,再使用乌式黏度计法测定相对分子质量,以备后用。

1.2.2　细胞水平转染实验　使用壳聚糖,对细胞汇合度约70%的3T3细胞进行转染实验,同时制备脂质体/DNA 复合物作为阳性对照,裸质粒DNA 作为阴性对照,共同培养36h,通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达,定量检测转染效率。

1.2.3　动物体内转染实验　取Balbc57/BL6小鼠24只,分为6组,每组4只,每组中1只为空白对照组,另外3只为实验组,由10μg GFP 质粒(1μg ・μl -1)、30μl P BS 和20μg 壳聚糖(1μg ・μl -1)配成的复合物共60μl,孵育30m in,用注射器注入小鼠股四头肌肉中,对照组注射10μg GFP 质粒和20μl P BS 的混合物,分别于注射1、2、3、4、5、6d 后,对6组小鼠进行解剖,取大腿股四头肌注射部位进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察荧光表达强度。

・4・2　结 果2.1　Na NO2法降解壳聚糖4种壳聚糖物理特征见表1。

表1　4种壳聚糖物理特征Tab1　The physical characteristics of thechit osan A,B,C and D各类壳聚糖编号Na NO2降解时间/m in粒径/n m多分散度zeta电位/mVA302500.0050.89B604500.503-14.36C906000.27-0.438D1202000.524.374由表1可知,A壳聚糖平均粒径较小,通过细胞膜的通透性较好,分布比较集中,zeta电位也为正值,有利于与带负电荷的质粒结合,B、C壳聚糖粒径较大,且zeta电位为负,D壳聚糖虽然粒径小于A,但是多分散度差,即其中包含的有效小粒径比较少,因此,也不利于对于细胞的转染。

后续的细胞转染结果也显示壳聚糖A的转染效率最好。

对原料壳聚糖和A壳聚糖使用乌式黏度计法[7]测定其黏度,根据公式η=κ(MV)α,κ=61589×10-3,α=0188,计算得到原料壳聚糖相对分子质量为46×107,降解30m in后的壳聚糖相对分子质量为717×107,说明降解是有效的。

2.2　细胞水平转染实验取降解时间为30m in的壳聚糖,按质粒与壳聚糖质量比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5复合后对3T3细胞进行转染,结果如图1所示,可以发现,在两者质量比为1∶3时,转染效率最高。

所以,按照最优比例1∶3,分别选用A、B、C、D壳聚糖进行转染实验,结果如图2所示, A壳聚糖转染效率最高。

虽然它们的转染效率都低于阳性对照(脂质体)介导的转染,但是壳聚糖几乎无细胞毒性,这一点大大优于脂质体。

因此,决定使用A 壳聚糖,以质粒与壳聚糖质量比为1∶3的比例制备复合物,进行以下体内水平转染实验。

2.3　动物水平转染实验分别在第1、2、3、4、5、6天对小鼠肌肉冰冻切片进行荧光观察。

结果显示,只有在转染后第4天观察到有绿色荧光蛋白的表达,强度中等,而对照组则无明显的绿色荧光表达,同时发现第4天时,有的小鼠肌肉注射处有炎症反应,炎症反应处绿色荧光特别强烈。

图1　流式细胞仪测得质粒与壳聚糖不同质量比的转染率F i g1　The tran sfecti on eff i c i ency of D NA/ch itos annanoparti cles w ith d i fferen t N/P ra ti o i n3T3cellsco m pared w ith L i pofect A M I NE2D NA co m plexes图2　流式细胞仪测得质粒与4种壳聚糖质量比1∶3的转染率F i g2　The tran sfecti on eff i c i ency of D NA/ch itos annanoparti cles w ith d i fferen t ch itos an s i n3T3cellsco m pared w ith L i pofect A M I NE2D NA co m plexes3　讨 论本实验中,通过降解高分子质量壳聚糖,制备获得了一系列适用于转染的粒径大小[8]在200n m到500n m 之间的壳聚糖。

在细胞转染中,壳聚糖对3T3细胞具有一定的转染效率,尽管低于脂质体,但是由于其为天然产物,对细胞毒性低[9],因此具有更好的应用前景。

在动物水平,壳聚糖/质粒复合物体现出好于细胞水平的转染效率。

这可能是由于:在细胞转染阶段,壳聚糖颗粒小,便于细胞对质粒/壳聚糖复合物的吞噬,以及该复合物易于从细胞溶酶体中逃逸[10],从而有利于质粒表达。

在体内转染中,存在一个复合物如何不被细胞间质和体液代谢掉的问题,与肿瘤治疗中EPR 效应相仿(即肿瘤组织所特有的高渗透性和高保留性),颗粒较大的高分子质量壳聚糖比较容易积聚在注射部位,从而实现对注射部位肌肉纤维细胞的有效转染。

因此,壳聚糖的分子质量并非越小越好,而是需要寻求细胞的吞噬和在注射部位停留时间之间的平衡。

本实验中选用的颗粒大小为250nm的壳聚糖正好满足了以上的要求,为壳聚糖在体内肌肉细胞中的转染,提供了潜在的可行性,同时也为壳聚糖在炎症部・5・张昊,等.壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究位的定点给药提供了一种潜在的可能。

壳聚糖作为基因载体的研究还不到20年,其与靶细胞的作用和转染机理目前尚不太清楚。

近些年来,通过口服和滴注鼻腔等各种给药方式,壳聚糖及其衍生物对大分子药物进行有效的输送取得了良好的效果[11212],但是对壳聚糖及其衍生物在肌肉部位直接进行基因转染的报道甚少。

本研究通过体内和体外实验证明,壳聚糖作为基因载体是一种潜在的、有效的、可直接应用于肌肉细胞转染的高分子材料,为基因治疗提供了一种新的手段。

[参考文献][1]卢大儒,邱信芳,薛京伦.基因转移研究进展[J ].生物工程进展,1996,16(2):5210,39.[2]MULL I G AN R C .The basic sciences of gene therapy [J ].Science,1993,260(5110):9262932.[3]R I CHARDS ON S C,K OLBE H V,DUNC AN R.Potential of l owmolecular mass chit osan as a DNA delivery syste m:bi ocompati 2bility,body distributi on and ability t o comp lex and p r otect DNA [J ].I nt J Phar m,1999,178:2312243.[4]L I U W G,Y AO K D.DNA 2polycati on nanos pheres as non 2viralgene delivery vehicles[J ].J Contr ol Rel,2002,83:1211.[5]G AO S Y,CHE N J N,XU X R,et al .Galact osylated l ow molec 2ular weight chit osan as DNA carrier for hepat ocyte 2targeting [J ].I nt J Phar m,2003,255:57268.[6]F I O NA C,M ac LAUGHL I N R J,MUMPER J W ,et al .Chit osanand depoly merized chit osan oligomers as condensing carriers for in vivo p las m id delivery [J ].J Contr ol Release,1998,56:2592272.[7]孙尔康.物理化学实验[M ].2版.南京:南京大学出版社,1998. [8]MAO H Q,ROY K,WALS H S M,et al .DNA 2chit osannanos pheres :transfecti on efficiency and cellular up take [J ].Pr oc I nt Sy mp Contr ol Release B i oactMater,1996,23:4012402.[9]H I RANO S,SE I N O H,AKI Y AMA Y,et al .B i ocompatibility ofchit osan by oral and intravenous ad m inistrati on [J ].Poly m Eng Sci,1988:8972901.[10]M I N AG AWA K,MATZ US AWA Y,Y OSH I K AWA K,et al .D irect observati on of the bi phasic conf or mati onal change of DNA induced by cati onic poly mers [J ].FE BS Lett,1991,295:67269.[11]曹健,陆锦芳.壳聚糖在生物大分子药物给药中的应用[J ].中国医药工业杂志,2002,33(7):3532357.[12]T AKE UCH I H,Y AMAMOT O H,K AWAS H I M A Y .Polysac 2charide coll oidal particles as delivery syste m s f or macr omole 2cules [J ].Adv D rug Deliver Rev,2001,47:39254.[收稿日期]2006202221Prepara ti on of low m olecul ar we i ght ch itos an and itseff i c i ency both in vitro and in vivoZHAN G Hao 1,L I S hu 2feng1,2,CHEN Yun 2z i 1,SHU Luan 1,HUA Zi 2chun1(1.S tate Key L aboratory of Phar m aceutical B iotechnology,N anjing U niversity,N anjing 210093,China;2.School of B asic M edical Science,Southeast U niversity,N anjing 210009,China )Abstract:O bjecti ve T o study the gene transfecti on efficiency of the l ow molecular weight chit osan (L MWC )nanoparticles both in vitro and in vivo under op ti m izing the ex peri m ental conditi on .M ethods The l ow molecular weight chit osan (LMWC )particles were p repared by oxidative degradati on with Na NO 2.Molecular weight was measured by testing the intrinsic viscosity .Its dia meter,the dia metric distributi on range and zeta potential were measured by scanning electr onic m icr oscope .The L MWC particles were l oaded with p las m id P I RES 2eGFP thr ough electr ostatic f orces and its l oading ability and the p r otecti on ability t o p las m id was studied .The transfecti on efficiency of chit osan 2DNA nanoparticles was tested both in vitro and in vivo .Results The size of L MWC was op ti m ized t o 2002600nm.The op ti m ized conditi on of depoly merizati on of the chit osan lead us t o the No .A chit osan .The surface charge was slightly positive with a zeta potential of +0.89mV.The molecular weight was ar ound 7.7×107.The transfecti on efficiency of chit osan 2DNA nanoparticles were t w o t o five ti m es higher than the backgr ound level in 3T3cells in relative light units,and t w o ti m es l o wer than that achieved by L i pofect AM I N EE 2DNA comp lexes .The study of the chit osan 2DNA m icr os pheres injected intra muscularly int o the quadricep s muscle of thigh of a rat model showed a str ong eGFP exp ressi on,es pecially in the infla mmat ory areas .However the t oxicity of the L MWC chit osan was much less than the traditi onal gene vect or,PE I and L i pofect AM I N EE,according t o p revi ous report,which showed a superi or bi ocompatibility .Conclusi on The L MWC chit osan,can be transfected both in vitro and in vivo ,may be a suitable poly meric carrier for gene therapy .Key words :chit osan;gene therapy;cell transfecti on;vect or・6・东南大学学报(医学版)　2007年1月,26(1)。