高温蛋白酶产生菌株的筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
耐高温蛋白酶高产菌株的选育
耐高温蛋白酶高产菌株的选育耐高温蛋白酶是一种在高温条件下仍能保持其催化活性的酶，能够在高温下催化生化反应，在制药、食品加工、生物制造等领域具有广泛的应用。
而菌株的选育是提高高温蛋白酶生产的重要手段之一。
一般来说，选育耐高温蛋白酶高产菌株需要分为以下几个步骤：（1）菌株筛选首先需要对天然微生物进行样品筛选，按照对温度、PH等生理参数适应性的要求进行选择，优先选择能在较高温度下生长并产生耐高温酶的菌株，如热门的枯草芽杆菌、厌氧嗜热菌、波形菌等。
筛选后的菌株需要进行基本鉴定和生长繁殖测试，并确定合适生长条件进行培养。
（2）单菌株培养选育高温蛋白酶高产菌株需要从单菌株入手，通过单菌株培养建立菌株库。
具体操作是从混合菌液中挑选单菌株进行分离纯化，然后在适宜菌落计数的培养基中进行扩增，得到比较纯的单一菌株。
（3）启动基因筛选启动基因是指在酶活性调控过程中起到重要作用的基因，比如转录因子、信号转导分子等。
通过筛选不同菌株的启动基因，能够分析菌株酶活性、酶产量等生理参数的变化，从而优选高酶活、高产量的菌株。
（4）基因工程改造通过基因工程技术，将高活性、高产酶的基因导入到新的细胞中进行表达，进而提高酶产量和酶活力。
目前，基因工程改造主要采用选择性筛选、拷贝数增加、等位基因增加等手段进行。
（5）酶活性评估选育出可行的耐高温蛋白酶高产菌株后，需要进行酶活性评估，以确定其酶活力和产酶能力，评价其在工业应用中的适用性。
酶活性评估一般采用激光荧光法、反应热法、电泳法等多种方法进行。
总之，选育出高产、高活力、耐高温的蛋白酶生产菌株需要长期不断的探索和尝试。
将基因工程技术应用于耐高温蛋白酶高产菌株的改造和选育中，能够进一步提高产酶效率和酶活力，推进相关产业的快速发展。
5产蛋白酶菌株的筛选2019
三、器材
1.菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的ห้องสมุดไป่ตู้奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
生物制药系 2019年12月
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。
因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。
本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。
2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。
采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。
常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。
3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。
培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。
3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。
将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。
3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。
通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。
此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。
4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。
4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。
常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。
4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。
将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。
5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。
这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
实验十二 产蛋白酶菌株的筛选
整理版
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2 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液， 取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混 合，40 ℃水浴显色30min，680nm测 定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度 为1是相当的酪氨酸质量（ μg ），及K 值。
整理版
6
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形 成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条 件和液体环境中生长的情况相差很大， 因此在平板上产圈能力强的菌株不一定 就是碱性蛋白酶的高产菌株。
整理版
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碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国 颁布标准QB747-80进行。
原理：Folin试剂与酚类化合物 （Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应 形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白 生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色 反应，通过分光光度计测定可知酶活大 小。
整理版
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5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋 白酶活力
用初筛获得的5株蛋白酶菌培养 48h。
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6 酶活力的测定
空白对照 发酵液（或其稀释液）1ml
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白1 ml
样品 发酵液（或其稀释液）1ml
整理版
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四 操作步骤
1 培养基和试剂的配制
（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体 培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉 3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到 9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧 瓶的装瓶量为50ml。
U=K×A×N×5/10 K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪 氨酸质量，本实验K=200 N：稀释倍数 A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差 5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的 １/５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ
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高温蛋白酶产生菌株的筛选
一、实验目的
1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术
2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法
3. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：
平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两方面：
1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
三、实验材料
1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，
并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。
（学生自取）
2. 培养基
①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。
组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min
②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）
* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。
各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。
pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。
③生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支
④其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL， 500 mL规格）、革兰氏染色液等。
四、实验内容
1.采样
学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。
2. 增殖培养（富集培养）
一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的
生长受到抑制，而对某些微生物可促进它们的生长，从而达到分离所需微生物的目地，这种培养称为增殖培养。
取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml 三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。
然后30℃，150 r/min，振荡培养24h。
取样镜检形成芽孢的情况。
3. 涂布分离
将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。
然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。
分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。
观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。
4. 纯化
用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。
5. 纯种鉴定
菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。
①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。
②产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。
6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使用。
五、结果与讨论
绘制菌体形态图，计算不同单菌落的H/C。
六、实验任务
获得的H/C比值大、产蛋白酶活力高的枯草芽孢杆菌菌株。