内毒素简介

先发生高血糖，转而为低血糖，大量糖元消耗，可能与肾上腺素大量 分泌有关。
血管舒缩机能紊乱
内毒素激活了血管活性物质（5-羟色胺、激肽释放酶与激肽）的释放。 末梢血管扩张，通透性增高，静脉回流减少，心脏输出量减低，导 致低血压并可发生休克。因重要器官（肾、心、肝、肺与脑）供血 不足而缺氧，有机酸积聚而导致代谢性酸中毒。
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细菌内毒素的简介
细菌毒素
外毒素 Exotoxin
内毒素 Endotoxi n
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外毒素（Exotoxin）：它是一种毒性蛋白质， 是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物 质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。 如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄 色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。 内毒素（Endotoxin）：是革兰氏阴性菌的细 胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态 时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附 在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主 要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
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石棉及活性炭吸附法
活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的 相对分子质量较大，这种方法适合于组 分较为简单的小分子的溶液中或水中内 毒素的去除。比较适合纯水溶液中内毒 素的去除。 缺点：由于活性炭的选择性较差，易吸 附有效成份，且纯化后溶液中的残余活 性炭不易去除。
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化学降解法
化学降解法是指用强酸、强碱或氧化剂 等使内毒素降解以达到去除内毒素的目 的，主要用于玻璃、塑料和其它高分子 材料器皿上内毒素的去除。 缺点：这种方法有可能造成目标产物的 流失、降解或失活，因此对于具有生物 活性物质溶液中的内毒素去除显然是不 利的。
Boivin：
Morgan：
热原
什么是热原？广义上说，微量即能引起恒温动物体 温异常上升的物质，统称为热原。广义的热原也包 括外因性热原(细菌性热原、化学热原)和内因性热原。 而狭义的热原即内毒素。在临床上，当受热原污染 的注射剂从静脉注入人体时，患者常在0.5h～1h内发 冷，继而出现寒颤、发热、出汗、呕吐等不适症状， 有时体温升高可至40℃以上，严重者甚至休克死亡， 这种现象称之为“热原反应”
外毒素与内毒素的对比
区别 来源 存在 部位 化学 成分 稳定性 作用 方式 毒性 作用 抗原性
外毒素 内毒素
G+菌与部分G分泌到菌外，少数是崩解释出 蛋白质 60～80℃，30分钟 与受体结合 强，对组织器官有选择性，引 起特殊临床表现 强，刺激机体产生抗毒素；脱 9 毒形成类毒素
G -菌 细胞壁组分，菌裂解后释出 脂多糖 160℃，2～4小时 刺激细胞分泌细胞因子、血管 活性物质 较弱，引起发热、白细胞增多、 微循环障碍、休克、DIC等 弱，抗体作用弱
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供试品细菌内毒素检查
供试品细菌内毒素检查
结果判断 当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为 阳性且阴性对照都为阴性时，实验方有效。
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供试品细菌内毒素检查
例 某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎
试剂的灵敏度为0.125EU/ml。 MVD=CL/λ=0.5/0.125=4 将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。
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取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用。 加样 8支管中2支加入0.ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入 0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性 对照管,2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水 浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。
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细菌内毒素的简介
危害：
内毒素能够直接作用于人体，激 活组织内的炎性细胞和炎症因子， 导致机体发热并产生全身性炎症 反应，继而引起弥散性血管内凝 血、休克、多脏器功能衰竭等严 重的病理生理症状，危及生命。
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内毒素在人体引起的症状
发热反应 白细胞反应 内毒素血症与内毒性休克 弥漫性血管内凝血
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白细胞反应 由于绝大多数被革兰氏阴性菌感染的 患者血流中白细胞总数都会增加，所以 现在医生在诊断前，为了初步区别是细 菌性感染还是病毒性感染，常常要化验 病人的血液，对白细胞进行总数测定和 分类计数。被病毒感染的病人，其白细 胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常 值范围内。
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糖代谢紊乱
内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体。 脂多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗原、 核心多糖和类脂A（脂质A） 组成。
内毒素的多糖结构
内毒素 endotoxin
G-菌中内毒素位 置
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内毒素的一般特性
性质稳定：具有耐热性，一般需要煮沸或更高温度才能被破 坏。 作用无特异性：内毒素致病症状和病理变化大致相同，如发热、 白细胞增高、腹泻、血管舒缩机能紊乱，糖代谢紊乱，严重时 甚至发生休克。 致热性： 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再 刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应 分子极性：多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性在水中呈不均 匀分布 酸碱性：与强酸强碱水解反应 鲎反应性

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细菌内毒素在人体引起的症状
发热反应
人体对细菌内毒素极为敏感。极微量（1-5纳克/公 斤体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续 约4小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌 不断生长繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素， 故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内 毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨 噬细胞等，使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因 子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的 体温调节中枢，促使体温升高发热。
此外，内毒素还能引起早期粒细胞减少血症， 以后继发粒细胞增多血症等。
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二.内毒素的检测方法
原理
器具的处理
供试品内毒素的检测
内毒素的 检测方法
内毒素检查方法
细菌内毒素检查包括：
浊度法
限量实验 凝胶法 半定量实验
光度测定法
动态浊度法
终点浊度法
显色基质法 动态显色法
终点显色法
可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有 争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
供试品 –– 结果是否有效 结果判断
供试品阳性对照 ++
阳性对照 ++ 有效
阴性对照 ––
该葡萄糖注射液内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定。
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细菌内毒素的去除
相分离法
离子交换色谱法 微孔பைடு நூலகம்膜法
内毒素的去 除
化学降解法
亲和色谱法
活性炭吸附法
250℃干烤1h以上
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超滤膜和荷电微孔滤膜法
由于内毒素具有较大的相对分子质量，因 此可选用超滤膜去除水中的内毒素。超滤膜 的孔径及材质的选择，需视被处理药物的相 对分子质量、特性、及药品中热原的含量而 定。 缺点： 1、此时操作过程中的压力较高，另外对部 分含有较大相对分子质量成份的医药制剂也 不合适。 2、因为在除去热原的同时会阻留或吸附药 液中的有效成份，使产品收率大受影响。
原理： 利用鲎试剂与微量内毒素产生 凝集反应的现象，以判断供试品 中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法。
阳性结果
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
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内毒素凝胶法检测原理
坚实凝胶
阳性“+”
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内毒素凝胶法检测原理
未形成凝胶 凝胶不坚实
阴性“—”
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器具的处理 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、60 分钟以上）去除，
塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 （目前多为无热原的一次性用品 ）或用强碱煮30分钟以 上。
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阳性对照溶液的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准 溶液。 供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成 2λ浓度的内毒素溶液。 阴性对照 即细菌内毒素检查用水。 鲎试剂的准备
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细菌内毒素的简介
20世纪40年代青毒素刚问世的时候，医 生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流 行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发 现这类病人，一律优选青霉素进行治疗； 且按照一般规律，用药剂量随病情严重 程度而递增。结果发生了意外，用大剂 量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少 患者却发生了休克而死亡……
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离子交换色谱法
离子交换色谱法是根据内毒素带有部分 负电荷的性质，用阴离子交换色谱来去 除内毒素。 缺点：这种方法不适合于溶液中存在其 它带负电荷物质的情况。
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亲和色谱法
亲和色谱法是利用物质的生物学特性来 达到物质的分离，是去除内毒素的一种 较为理想的方法。只要采用适当的配基， 将它固载于亲和色谱的基质上合成出亲 和介质，就可使它成为一种去除内毒素 的高效能、高选择性方法。相对于上述 方法来说，亲和色谱法具有其显著的优 越性，去除率高、选择性好
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鳌试剂的发现
1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌 时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量革兰 氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了 鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑ 准确，目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等 方面。
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内毒素凝胶法检测原理
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结语
由于生物制品（如干扰素、白介素、肿 瘤坏死因子等，以及其它血液制品）在 未来的基础研究和临床治疗中前景诱人， 尤其是将具有治疗作用的蛋白质经生物 工程技术在大肠杆菌中表达，所得到的 产物中含内毒素相当丰富，故生物工程 的药物生产面临着内毒素的去除问题。 从这一点看，制备无内毒素污染的生物 制品具有很大的前景。
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