菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋 白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果 的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是 为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影 响。需要多次实验确定所加的量，避免 反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中， 可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。 并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质 的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠 萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain）， 从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分 解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋 白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一 种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、 明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶 解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症； 它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方 法
菠萝蛋白酶的制备及活力测定
1%酪蛋白溶液（ml）
8
1
8
0
8
0
迅速摇匀，室温下静置30min
取上清液于275nm波长下测定吸光值
五、结果与讨论
1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。
(A2+A3)/2－A1
酶活性= —————————
0.15×1/100×1/10
2、洗涤与保护
（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；
（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；
四、实验步骤
1、提取
（1）取一定量的菠萝皮汁（约ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；
（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；
（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。
4、酶活测定
（1）酶液制备
取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS(磷酸盐缓冲液)定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。
（2）活性测定
取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定）
试剂
管号
1
菠萝蛋白酶的制备及其活力测定
1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。
2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。
3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。
1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。
4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。
0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。
0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。
5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。
0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。
】扩大10倍体积。
6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。
激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。
】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。
1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。
也可以用6mol的稀释。
器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。
菠萝蛋白酶活力的测定
菠萝蛋白酶活力的测定•碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应，利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
•（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现不同深浅的蓝色）1、实验材料（1）实验器材榨汁机、电热恒温水浴锅、分析天平、紫外分光光度计等。
（2）实验试剂1）对照样品溶液：酪氨酸溶液0.05g/L，用0.1mol/LHCl溶液配制。
2）菠萝汁：市售菠萝压榨后过滤即得。
3）菠萝汁稀释液：称取L-半胱氨酸盐酸0.53g，EDTA0.22g，分别兑少量溶解后，混合，用NaOH(0.1mol/L)调pH至4.5，加水至100mL（新鲜配制）。
4 ）底物溶液：精确称取酪蛋白0.6g ，加Na2HPO4溶液（0.005mol/L ）80mL ，用1mol/L 盐酸调pH 至7.0 ，加水至100mL （新鲜配制）。
5 ）三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸溶液1.80g ，醋酸钠2.99g ，加水少量使溶解，加冰醋酸1.98mL ，加水稀释至100mL 。
2、操作步骤（1）供试溶液的配制将菠萝切碎，置于榨汁机中榨汁，用4层纱布过滤，弃初滤液，取滤后菠萝汁10mL，加菠萝汁稀释液10mL，放置15min，制成供测试用液。
（2）供试液酶解后吸光度值的测定取上述供试液1mL，置带塞试管中，于37℃预热10min后，迅速加入已经37℃预热10min的底物溶液5mL，加入起准确计时反应10min，立即加入三氯醋酸5mL终止反应，混合后过滤，滤液在275mn处以水作参照，测吸光度A。
（3 ）空白试验取上述供试液1mL ，置带塞试管中，于37 ℃预热10min 后，迅速加入已经37 ℃预热10min 的三氯醋酸5mL ，加入起准确计时反应10min ，立即加入底物溶液5mL 终止反应，混合后过滤，滤液在275nm 处以水作参照，测吸光度A0。
菠萝蛋白酶的提取分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定１5食安(1)班张凯摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法与透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度得菠萝皮经两种不同得纯化方法处理,菠萝皮中得蛋白酶都能被有效纯化,但就是蛋白酶活性会损失一部分、关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性;前言菠萝蛋白酶(bromelａｉｎ)就是从菠萝植株中提取得一类蛋白水解酶得总称,主要存在于菠萝茎与果实中,根据提取部位得不同,分为茎菠萝蛋白酶与果菠萝蛋白酶。
Mａrcaｎo于18９1年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶、随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药与化工领域有很好得利用价值。
1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。
目前,菠萝蛋白酶得一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域、随着提取纯化技术得不断进步,高活性得菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工与食品领域。
[１］利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶得获取途径与应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境得污染;随着市场对菠萝加工产品需求量得增大,对于菠萝皮得研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要得功能成分蛋白酶得分离、纯化与性质得研究更有意义、[２]本文通过对菠萝皮蛋白酶得提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性得影响因素,并解决实验存在得一些问题、1实验材料与仪器１、1实验材料与试剂新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量８00０~１４０00),0。
１mo1／ＬpH 7.8磷酸缓冲液配制(ＰBS),0.0１mｏ1/L pH 7。
８磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mｍo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mｍo１/L EDTA—Na2(乙二胺四乙酸二钠)],10%三氯乙酸(TCＡ)。
1、2实验仪器７2２型可见光分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;７52型光栅分光光度计:北京光学仪器厂;TＤL－６0B台式离心机:上海安宁科学仪器厂;D5Ｍ离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;DK-８Ｄ电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;可控硅恒温水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司;AMPUT电子天平:深圳安普特科技有限公司;BS１１０S分析天平北京赛多利斯天平有限公司;ＤS—１型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;HZS-H型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一．实验目的与要求（1）掌握菠萝蛋白酶的制备与纯化的基本原理和方法（2）掌握菠萝蛋白酶活力测定方法（3）菠萝蛋白酶的稳定性研究（4）菠萝蛋白酶的修饰（5）比较修饰酶与未修饰酶的活力二．实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33000,能分解蛋白质、肽、脂和酰胺等。
它的水解活性较木瓜酶高10倍以上。
因此有广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清。
还用于胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增大而增大，这种现象称为盐溶。
当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐减小，直至在溶液中沉降出来，即为盐析。
加入中性盐后，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间相互聚焦而沉淀。
凝胶层析是广泛应用于蛋白质、酶、和核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。
分子量大于允许进入凝胶“网眼”的范围的物质完全被凝胶排阻，随洗脱液先流出层析液，分子量小的物质较晚地流出柱。
本实验采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75作为固相载体，它适用于1500-30000之间的多肽与蛋白质的分离。
Folin-酚试剂法所用的试剂由两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。
试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色，由于蛋白质（或多肽）中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。
蓝色深浅与蛋白质浓度相关，在一定浓度范围内呈线性关系，因此可作比色法测定。
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菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。
1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。
Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。
菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木糖(xylose，xyl)、岩藻糖(fucose，Fuc)、甘露糖(mannose，Mall)和N一乙酰葡萄胺(N．aceltylglucosamine，GIcNAC)组成用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为33200D，等电点为pH9．55，酶液的最大吸收波长为280nm，0．051％浓度的酶液在280nm的光吸收值达0．984(Murachi，et a1．，1964)。
分子中有4个N一乙酰化的氨基己糖，含糖2．1％，分子中有285个氨基酸残基，含氮量为15．88％。
在Murachi等研究的基础上，1989年，Ritonja等排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有20种氨基酸，共212个，C端的氨基酸为谷氨酸(Glu)，N端的氨基酸为丙氨酸(Ala)，相对分子质量为23828。
菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、pH、金属离子等的影响。
研究表明(章佩芬等，1999)：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于55～60℃，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在6．5～7．5，在7．1附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的pH范围在3．5~4．5；菠萝酶反应影响不大，MgCl2、CaCh对酶有一定程度的抑制作用。
生产过程中，为了保护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂，如EDTA、维生素C、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。
1999年，H．H．Liang 等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热稳定性，延长酶的半衰期。
1．3菠萝蛋白酶的提取纯化方法．菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法主要有三种(王平诸等，2002)：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。
流程(1)高岭土吸附法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(高岭土吸附)一吸附物(洗脱、压滤)一洗脱液(盐析)一盐析物(离心)一湿粗酶饼(溶解、过滤)一澄清液(沉淀)一湿酶(干燥)一精品(2)单宁沉淀法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(加稳定剂)啼稳定液(加单宁)一单宁沉淀物(洗脱)一滤液(干燥)一酶制品(3)超滤浓缩法工艺流程菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(超滤浓缩)一浓缩液(降温、加沉淀剂、沉淀)一湿酶(减压干燥)一酶制品步骤2．4．1．1酪蛋白溶液的配制称取酪蛋白0．609，加0．05mol／L磷酸二氢钠溶液80mL，搅拌溶解后，加0．1mol ／L盐酸液调节pH至7．0，加水至100mL即得。
2．4．1．2酶稀释液的配制称取L．半胱氨酸0．269，EDTA 0．229，分别加适量水溶解后，调节pH至6．0，加水定容至100mL，即得本液，现配现用。
2．4．1．3三氯乙酸溶液的配制称取三氯乙酸17．999，加醋酸钠29．949，和冰醋酸18．9mL，加适量水溶解后，加水至1000mL，摇匀，即得。
2．4．1．4磷酸缓冲液量取0．2 mol／L Na2HP04溶液1 2．3mL与87．7mL 0．2 mol／L NaI--12P04 溶液混合，定容至500ml即得0．05mol／L，pH6．0磷酸缓冲液。
2．4．1．5层析缓冲液称取1．219 Hs碱，0．589 NaCl，1 mol／L的EDTA lmL，加蒸馏水稀释到1L，用磷酸盐调pH5．0～8．O。
梯度洗脱时高浓度氯化钠洗脱液的配制，加氯化钠87．669，至1．50mol／L，其余数据同上。
2．4．1．6 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液储存液：①2 mol／L Tris·HCI(pH8．8)，100mL称取24．29Tris碱，加50mL蒸馏水，．缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。
②l mol／L Tris-HCI(pH6．8)，100mL称取12．19秭s碱，加50mL蒸馏水，缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。
③10％(W／V)SDS，100mL称取109 SDS，加蒸馏水至100mL，室温保存。
④50％(V厂V)甘油，100mL倒取甘油(100％)50mL，加入50mL蒸馏水。
⑤l％(W／V)溴酚蓝，10mL称取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至100mL，搅拌至完全溶解，过滤除去聚合的染料。
工作液：①A液：丙烯酰胺储存液，10mL30％(W／V)丙烯酰胺，O．8％(WⅣ)双丙烯酰胺。
②B液：4X分离胶缓冲液，100mL(4℃下保存)75mL 2mol／L Tris-HCl(pH8．8)，4mL 10％SDS，21mL蒸馏水。
③C液：4X堆积胶缓冲液，100mL(4℃下保存)50mL lmol／L Tris．HCl(pH6．8)，4mL 10％SDS，46mL蒸馏水。
④10％过硫酸铵，5mL0．59过硫酸铵，5mL蒸馏水，密封于磨口试管，4"C下保存。
⑤电泳缓冲液，lL39 Tris碱，14．49甘氨酸，lg SDS，加蒸馏水配成1L溶液，室温下保存。
⑥2x样品缓冲液，100mL0．25mol／L"Iris-HCl(pH6．8)，4％(W／V)SDS，20％(V／V)甘油，痕量溴酚蓝，浓缩胶缓冲液(4X)5mL，SDS(干粉)0．49，甘油(50％)4mL，溴酚蓝(1％)201xl，加水至100mL。
⑦含2．巯基乙醇的样品缓冲液(1X)现用现配，稀释2X样品缓冲液储液，加入2．巯基乙醇至终浓度为5％(V／V)。
⑨灌制x％分离胶的计算A液X／3mL，·B液2．5mL，蒸馏水(7．5制3)mL，10％过硫酸铵509L，TEMED 501．t l(X>8％时，用10u 1)总量10mL。
2．4．2酶活测定方法对于供试酶液(2．4．4．1)量取5mL(酶制品称取样品0．0159，置研钵中，加适量酶稀释液研磨10rain)用水移至100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，量取5mL至10mL量瓶中，加酶稀释液至刻度，摇匀，放置15min后，准确量取lmL，置具塞试管中于37+0．24C水浴中保温10min，精密量取在37±0．2"C中保温的酪蛋白溶液5mL，迅速加入混匀，同时开动秒表，准确反应10rain，立即加入三氯乙酸溶液5mL，摇匀，过滤。
另取样品溶液lmL置具塞试管中于37+0．2"C保温10min，精密加入37℃三氯乙酸溶液5mL，准确反应10rain，立即精密加入酪蛋白溶液5mL，摇匀，过滤，滤液作空白，按照分光光度法(中国药典1977版)在275nm处测定吸光度(施特尔马赫，1992)。
准确称取酪氨酸标准品50mg，置100mL量瓶中，加O．1mol／L盐酸溶液至刻度，摇匀，准确量取lmL 置10mL量瓶中，加O．1mol／L盐酸溶液至刻度，摇匀(每lmL含酪氨酸5099，以水作空白，在275nm处测定吸光度。
在pH7．0，37*(2条件下，每分钟水解酪蛋白生成lpg／L酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。
酶活力计算公式：每克(mL)菠萝蛋白酶活力U／g(U／mL)．’=石A×so×。
11。
×意‰ 以10 样品体积(重量)A：样品吸光度As：酪氨酸吸光度11：样品最后反应完毕体积10：反应时间50：每mL含有酪氨酸的烬数2．4．3蛋含量测定方法采用考马斯亮兰G．250法(George R，1973)测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取10mg牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至100mL，配成0．1mg／mL的标准蛋白溶液。
②考马斯亮兰G．250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G．250，溶于50mL 95％的乙醇后，再加入120mL 85％的磷酸，用水稀释至lL，过滤后贮于棕色瓶中。
③标准曲线的绘制：取7支试管，编号后如表1，混匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定(应在lh内完成)，以牛血清白蛋白含量(嵋)为横坐标，以吸光度为纵坐标。
2．4．4．2纳米n02吸附法供试酶液中加纳米Ti02搅拌均匀一离心(4000 rpm，15min)一取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱一搅拌(30rain)一离心(4000 rpm，15rain)一取上清液一超滤浓缩一冷冻干燥一酶制品。
操作要点：①吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米Ti02搅拌均匀，吸附20～30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。
②超滤：洗脱液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。