膜片钳技术
膜片钳实验与技术
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单击输入目录标题 膜片钳实验原理 膜片钳实验操作流程 膜片钳实验数据分析 膜片钳实验的应用实例
膜片钳实验的未来发展与挑战
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膜片钳实验原理
膜片钳技术的基本原理
膜片钳实验原理：通过玻璃微电极接触细胞膜，记录单一离子通道活动的 电位变化，从而研究细胞膜离子通道的特性。
膜片钳实验操作步骤
准备实验器材：包括膜片钳 放大器、微操纵器、微电极、
细胞夹持器等
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细胞贴片稳定：等待细胞贴 片稳定后，进行下一步操作
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开启膜片钳放大器：开启放 大器，调节放大器参数，确 保记录到有效的膜电流信号
数据记录：记录膜电流信号， 进行分析和处理
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新型膜片钳技术的研发，提高实验效率和准确性 应用人工智能技术，实现自动化数据分析与处理 结合其他技术手段，拓展膜片钳技术的应用领域 持续优化膜片钳设备，降低实验成本，提高普及率
膜片钳实验在多学科交叉中的应用前景
神经科学领域：研究神经元电活动与行为之间的联系 生理学领域：研究生物体的生理功能和机制 药理学领域：研究药物对细胞膜通道的影响和作用机制 生物医学工程领域：开发新型膜片钳技术，提高实验的灵敏度和特异性
膜片钳技术的特点：高灵敏度、高分辨率和高时间分辨率，能够记录单个 离子通道的活动。
膜片钳技术的应用范围：研究细胞膜离子通道的生理功能、药理作用和药 物作用机制等。
膜片钳实验的影响因素：电极内液的成分、温度、细胞内外的离子浓度和 pH值等。
膜片钳实验的应用范围
神经科学：研究神经细胞的电生理特性 药理学：药物对膜通道的影响 生理学：研究生物膜的离子通道功能 病理学：研究疾病状态下膜通道的异常变化
膜片钳技术参数
膜片钳技术参数一、膜片钳放大器系统（1）膜片钳放大器*1. 双电极膜片钳放大器用于细胞内和细胞外记录、膜片钳记录(全细胞、巨膜片、游离膜片)、电流测定法/伏安法、离子选择电极的测量、人工脂双层记录2. 电压钳模式下提供4种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ、50 GΩ），可以测定0.2 pA～200 nA范围的电流。
电流钳模式下提供3种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ），可以测定2 nA～200 nA 范围的电流。
3. 膜片钳放大器具有两个相同且独立的探头，为计算机控制，多数功能可通过点击鼠标而自动完成。
4. 全细胞膜电容补偿范围：Rf=500M时，Cm 1-100pF/Rs 400k-1000M串联电阻补偿范围：带宽：0.32-16kHz;校正值：0.4-1000M(500M时)5. 输出增益范围：主输出：1,2,5,10,20,50,100,200, 500, 1000, 2000；主输出滤波频率范围：4－极Bessel低通滤波(Hz)：2Hz-30kHz （2）数模转换器1转换器为即插即用型设备，能被Windows系统自动识别。
*2 为一台单独的仪器，不跟膜片钳放大器组合为一台仪器。
具有丰富数量的模拟/数字输入/输出端口，方便在软件中进行额外的附加控制。
3 16位高分辨率、低噪声转换器。
模拟信号输入通道数：8；模拟信号输出通道数：8；数字输出通道数：8。
4 采样速率：1 Hz - 500 kHz。
5 输入电阻: 1 MΩ；输入型号；TTL兼容制系统,方便外接其他刺激器，隔离器等。
输出电阻：< 0.5Ω6 输出电流：±4mA；数字化噪音< 1 mV7 系统自带消除噪音功能。
最大输入信号±10 V；消除最大噪音幅度20 V；噪音消除：线频率50Hz和谐波至10 kHz；取消相应时间< 1 s（3）记录和分析软件*1. 分析程序可对数据脱机处理，不需要使用密码锁2. 既包含采样程序又包含分析程序3. 膜测试功能在记录每条扫描线时可计算串联电阻Ra和膜电容4. 如果施加了漏减功能，则可同时自动记录下漏减前后的电流5. 在对每条扫描线进行记录时，可采用两个不同的采样频率进行6. 可以设置灵活的基础刺激和条件刺激方式用来不间断记录长时程增强效应和长时程抑制效应（LTP/LTD）。
膜片钳
㈢分析
1.事件检测方法——50％阈值检测法： 将阈值水平设在开放水平与关闭水平中间
2.单通道电流幅度和电导的分析 ➢目的：揭示通道的通透性机制；帮助区分通道的类 型、通道不同的亚单位组成以及突变等 ➢单通道电流的分析—— 幅度直方图 ➢单通道电导的计算 ⑴斜率电导：步阶电压（voltage step）；斜坡电压 （voltage ramp） ⑵拟合电流幅度直方图：高斯拟合
Rs的影响：使膜电位对命令电压的反应时间延迟；产生 电压降，影响钳制电位的数值；与膜电容形成一个单极 RC滤波器，限制了摄取电流信号的频带宽。
膜电阻（Rm）：指电流通过细胞膜时所遇到的阻力。 在静息状态下，Rm主要来自脂质双分子层的电阻。
3. 膜漏电流去除：
➢电容器（capacitor）：
被绝缘体隔开的两个导体 的组合，其储存电荷的能 力用电容（capacitance） 表示。
㈡ Ag/AgCl电极
Ag + Cl-
电子从Ag/AgCl 电极流向浴液
AgCl +e电子从浴液流向Ag/AgCl电极
➢长时间导通电流，AgCl会消耗掉，要定期镀AgCl： 含Cl-的溶液，长度为1～1.5cm
➢玻璃微电极尾端烧灼，防止AgCl被刮掉
电极电阻
二、封接
测试脉冲（20mV） 产生的电极电流
原因：离子通道的开放导致膜电阻迅速降低，电流 和电压的关系偏离了欧姆定律。
分外向整流和内向整流
外向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近y轴
内向整流：指随膜电位的去极化，I-V曲线靠近x轴
（2）离子通道的激活（activation） （3）离子通道的失活（inactivation） 衰减（decay）：通道在激活因素持续存在条件下的 失活。用衰减的时间常数来表示 稳态失活（steady-state inactivaion）：反映通道 失活数目的电压依赖性，可用失活曲线表示 （4）通道失活后的恢复 通道失活后，必须将激活因素去除并维持一定时间， 才能使通道脱离失活状态，再次给予激活因素时通道 才能恢复开放。维持时间即通道失活后的恢复时间。 （5）离子通道的去激活（deactivation） 指在激活因素结束时通道的关闭过程，所记录到的电 流称尾电流。有些离子通道的尾电流也具有电压依赖 性，关闭过程呈指数分布。
膜片钳技术概述
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境 的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。 有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光 敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进 行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色 布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜 优点： 具有较好的视觉效果 便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。 具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出 荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子 结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的 荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算 出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的 方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该 细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞 膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析 这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的 电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为 快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2， 由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因 跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产 生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时， 可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。 膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它 把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大 器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形 式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种 典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪 声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
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04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术原理
膜片钳技术原理膜片钳技术是一种常见的实验技术，广泛应用于生物学、药理学、细胞生物学等领域。
它是利用一种特殊的仪器，通过对细胞膜的控制和操作，实现对细胞内外环境的调控和研究。
膜片钳技术的原理主要涉及到膜片形成、膜片钳的构造和工作原理等方面，下面将对这些内容进行详细介绍。
首先，膜片的形成是膜片钳技术的基础。
膜片是由玻璃或石英毛细管制成的，其内外涂有一层导电性金属。
在形成膜片的过程中，需要将毛细管和细胞膜接触，利用毛细管的吸附作用将细胞膜抽附到毛细管上，形成一个微小的膜片。
这一步骤的关键是要保持膜片的完整性和稳定性，以确保后续实验的准确性和可靠性。
其次，膜片钳的构造是实现膜片钳技术的重要工具。
膜片钳通常由微操作系统、压力控制系统、电压控制系统等组成。
微操作系统用于控制膜片的形成和定位，压力控制系统用于控制膜片与细胞膜的接触压力，电压控制系统用于记录和调节膜片与细胞膜之间的电压变化。
这些系统的协同工作，使得膜片钳能够对细胞膜进行高度精准的操作和控制。
最后，膜片钳技术的工作原理是通过对膜片与细胞膜之间的接触和电学特性的测量，实现对细胞内外环境的调控和研究。
在实验中，可以通过改变膜片与细胞膜的接触压力和电压，观察细胞膜的电学特性和通透性的变化，从而研究细胞的离子通道、受体通道等功能。
同时，也可以利用膜片钳技术对细胞内外环境的离子浓度、pH值等进行精准调控，以研究细胞的生理和病理过程。
总之，膜片钳技术是一种重要的细胞生物学实验技术，其原理涉及膜片的形成、膜片钳的构造和工作原理等方面。
通过对这些原理的深入理解和掌握，可以更好地应用膜片钳技术进行细胞内外环境的调控和研究，为生物学、药理学等领域的研究工作提供重要的技术支持。
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
膜片钳技术及应用
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
玻璃微电极及膜片的几何形状
电极拉制仪
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
高阻封接形成的电流图
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
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2008级硕士研究生膜片钳技术试题
请用A4纸书面手写，严禁抄袭。
下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！
问答题（共100分）
1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？
答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。
膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。
实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。
2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？
答：膜片箝有四种分类：
（1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode）
微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。
此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。
该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。
但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。
(2)全细胞记录法(Whole-cell recording)
在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。
该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。
但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。
(3)膜内面向外式（Inside-out）
按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。
是在细胞吸附式的基础上改进而成。
其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。
(4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。
此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。
3、膜片钳技术的应用范围有哪些？
答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率,还可用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。
同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。
结合分子克隆和定点突变技术,膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。
另外,利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。
4、膜片钳实验的基本操作步骤包括哪些？
5、使用打孔全细胞膜片钳记录（perforated whole-cell patch clamp recording）的
优点是什么？
答：膜片钳全细胞记录相比，打孔膜片记录技术有如下优点：
(1)由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不通透。
因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使等分子仍可正常运作。
(2).因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子浓度就不受电极液的影响。
因此，可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离Ca2+的水平。
(3).该技术对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，一次记录持续3小时并不少见。
(4).在用负压或电压脉冲打破细胞膜以形成膜片钳全细胞记录时，常使高阻密封丧失，而该技术则很少见高阻密封丧失。
(5).该技术得到的电极串联电阻较膜片钳全细胞记录的低或至少相等，并且相当的稳定。
(6).用该技术记录时的细胞膜电容更易补偿。
6、传统的全细胞膜片钳记录（conventional whole-cell patch clamp recording）过
程中怎样进行质量控制？
答：全细胞记录时，电极液应为低Ca2+,高K+溶液。
高阻密封形成后，置MODE 于VC,用17 C-FAST和19 τ-FAST旋钮抵消由于电极头和电极管壁形成的瞬时电流。
然后直接向电极内作短暂的脉动抽吸，或给予脉冲电压(200mV)均可使电极内的细胞膜破裂,此时电容瞬时电流明显增大。
用18 C-SLOW和20 τ-SLOW旋钮将这一电流调小，即可进行全细胞记录。
因电极与细胞内相通，２４ VP OUT输出为跨膜电位。
全细胞记录的几个注意事项:
1.电极尖端直径比较宽而且锥度陡，电阻约1-3MΩ。
2. 放大器的反馈电阻为10GΩ，因此当记录电流超过1nA时，放大器饱和，此时应使用反馈电阻小的JZ-221J探头。
(3)电极内液可以迅速改变细胞内液，因此电极液应与细胞内液一致,典型的哺乳动物细胞内液为(mmol/L)：140KCl, 2 MgCl
, 11 EGTA-KOH, 1 CaCl 2, 10
2
HEPES，PH7.2。
其中H+和Ca2+浓度最为重要。
7、建立膜片钳记录系统大致需要哪些基本设备？
答：建立膜片箝记录系统大致需要一下基本设备：(1).膜片钳放大器(2). 示波器(3). 刺激器(4). 倒置显微器(5). 微操纵器(6) 电信号记录用录音机或数字式录像机(7). 屏蔽笼及防振工作台 (8). 微电极毛坯拉制器、微电极拉制器及微电极抛光仪(9). 电信号处理软件、计算机及其接口
8、膜片钳实验的主要影响因素是什么？。