最强ELISA工艺流程图
ELISA实验 ppt课件
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
2 ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
4 对照设定
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果 的对照。
阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含 蛋白保护剂的缓冲液为基质。
加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物 质的量。
1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之 间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
1.1.4 敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
ELISA的试剂准备A
固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但 空白值也略高。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA试剂配制及实验流程—BDY
E L I S A试剂配制及实验流程—B D YThe document was finally revised on 2021ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制：(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：Na2CO3NaHCO3加蒸馏水至1000ml。
（用时稀释成1x，加%BSA）(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：%Tween-20加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液：KH2PO40.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl加蒸馏水至1000ml。
(3) 封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。
(4) 稀释液：牛血清白蛋白 %加PBS 缓冲液100ml。
(5) 底物缓冲液：Na2HPO4(无水L，带12结晶水L) 取柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取加蒸馏水至100ml。
(或Na2HPO4·12H2O 1.84g柠檬酸·H2O 0.51g加蒸馏水至100ml)(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-TMB(2mg/ml水)底物缓冲液30% H2O 2总体积1ml。
TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉） 0.004g底物缓冲液 10ml30% H2O2总体积10ml。
(8) 终止液(2M H2SO4)：在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。
操作步骤：1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。
(简称洗涤，下同)。
ELISA测定的常用模式一--测定的常用模式一--双抗体夹心法
ELISA 测定的常用模式一测定的常用模式一------双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA 模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA 试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、。
FP 和hCG 等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA 测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a 复合物的形成将直接与在第一步中形成的b 复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S 形变化曲线(图2—2)。
而一步法双抗夹心ELISA 的反应曲线则为钟形曲线(图2—3)。
实用ELISA教程PPT课件
• 颜色普遍都黄色，虽然还有颜色深浅的区别。
刚做出来的时候，颜色淡的近乎白色，几乎没有 黄色。
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• X,Y轴都取对数之后，可以看见点与点之间成直线。
但是，R2只有0.967，一般比较好的标准曲线， 应该是0.99左右。 • D1与D2的重复性不好（标准品浓度， 125pg/ml），可能是个人操作原因。
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• 第二天早上，来洗掉包被液。 注意事项： 1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按 照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一 点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不 能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。
ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子 （可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一 般是450nm的OD值）来检测，就只能用白 底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。
第一步，拿到板子，还有封盖膜。
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• 第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜 的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为 了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。 室温孵育过夜。
• 样品稀释的一般原则
• 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中 待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、 中、低的不同，分别采取不同的稀释方案：
ELISA实验详细流程及溶剂配置参考
1溶液配制1.1PBS：磷酸盐缓冲呀（10X）加入双蒸水900ml左右，调节PH7.4，定容至1000ml。
1.2PBST：磷酸盐吐温缓冲液Tween-20为一种非离子表面活性剂，一种去污剂，能够在不破坏蛋白质的情况下，洗脱非特异性结合的抗体。
Tween-20既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是：借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的。
洗涤缓冲液：含0.05% Tween-20 的中性PBS（即1*PBST）配置：100ml 10*PBS; 2.5ml 20% Tween-20，定容至1L调节PH7.41.320% Tween-2010g Tween-20, 加蒸馏水约30ml, 可4℃过夜，溶解均匀后定容至50ml。
1.4包被缓冲液0.05mol/L碳酸缓冲液（PH9.6）配制：碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，定容至500ml，测PH9.6.1.5封闭液要求：用4℃预冷的1*PBST配置成2%的BSA溶液配制：10ml 2%BSA封闭液：0.2g BSA粉末，溶解于10ml PBST中，摇晃溶解，后放入4℃冰箱（最好提前一天配制，防止泡沫过多）。
保存：4℃1.6Tris稀释液1.7血样稀释液A.小肽标签稀释液母液：60mg/ml（-80℃保存）配制：1ml 60ug/ml的小肽：1ml 4℃2% BSA 1*PBST+1ul小肽母液，混匀，4℃保存B.血清稀释液血清稀释液：5ug/ml（溶质是小肽，溶剂是封闭液）一块96孔板需要12ml血清稀释液，即11ml的封闭液，1ml 60ug/ml的小肽1.8显色液TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。
在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝色产物。
抗体效价的Elisa测定实验步骤
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定实验步骤
petitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein
抗体效价的Elisa测定实验步骤
抗体效价的Elisa测定实验步骤
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定实验步骤
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波 长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、 48孔或24孔)。
按 “ MAP” 键 选 择 阅 读 方 式 ( Auto 或 Manual) 、 阅 读 方 向 （Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起 始 位 置 （ 输 入 编 号 ） 、 空 白 Map （ Air 、 Full 、 Const 、 Column、P-Down、P-Across）。
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项
ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。
洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
一、ELISA样本的处理ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划注意事项1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x22、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深，7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存二、标本类型01、ELISA的常见标本液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等培养细胞组织标本02、ELISA标本的保存一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。