相对荧光定量法检测人体2',5'-寡聚腺苷酸合成酶相对表达水平
非核苷类抗病毒药物阿比多尔的研究进展
· ·３ ０ ８
Ｃ ｈ ｉ ｎＪＥ ｖ ｉ ｄＢ ａ ｓ ｅ ｄＰ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ Ｊ ｕ ｌ ｙ２ ０ １ １ ， Ｖ ｏ ｌ ６ ， Ｎ ｏ４
１ ７ ］ Ｌ ｅ ｎ ｅ ｖ ａ 等［ 对阿比多尔耐药病毒变异株的研究表明， Ｈ Ａ ２
Ｆ Ｎ的产生， 在给药后 明， 正常小鼠口服阿比多尔后可诱导 Ｉ １ ８ｈ 达高峰， 并可增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能， 促进正常 和免疫低下小鼠的非特异性免疫功能， 增强其体液免疫和 细胞免疫功能。
－ １ 有学者分别用阿比多尔 １ ０ ０ 、 ３ ５ ０和 １２ ０ ０ｍ ｇ ·ｋ ｇ · － １
－ １ － １
作者单位 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 武汉， ４ ３ ０ ０ ３ ０ 通讯作者 方峰， Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｆ ａ ｎ ｇ ｆ ｅ ｎ ｇ ５ ６ ＠ｈ ｏ ｔ ｍ ａ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｍ
中国循证儿科杂志 ２ ０ １ １年 ７月第 ６卷第 ４期
２ ， ３ ， １ ８ ～ ２ ０ ］ Ｈ ６ Ｎ １和 Ｈ ５ Ｎ １病毒均有抑制作用 ［ 。
亚基的单个氨基酸替换会使阿比多尔抑制膜融合的作用减 弱， 因此进一步确认其作用位点位于 Ｈ Ａ ２亚基。近年来， １ Ｎ １ 、 Ｈ ２ Ｎ ２ 、 Ｈ ３ Ｎ ２ 、 Ｈ ９ Ｎ ２ 、 国内外研究表明， 阿比多尔对 Ｈ
ｄ 对大鼠进行连续 ４周的长期毒性实验， 发现 １ ０ ０和 ３ ５ ０ ·ｋ ｇ ·ｄ 组大鼠的一般状况、 体重、 进食量、 血液学、 ｍ ｇ
RNA干扰
定义
• RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、 由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源 mRNA高效特异性降解的现象。
类型
• 转录水平的基因沉默(TGS)：由于DNA修饰 或染色体异染色质化等原因使基因不能正 常转录。 • 转录后水平的基因沉默(PTGS)：PTGS是 启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解 机制。
体内表达
• 前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs， 并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转 到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于 PCR的表达框架则属于从转染到细胞的 DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两 种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
siRNA表达载体
• 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小 的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括 大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由 于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6 个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单 链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周 甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
体外转录
• 用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的 siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个 缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在 除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的 siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因 被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人 员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的 缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基 因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治 疗
分生必背大题
分生必背大题1.写出乳糖操纵子的结构并试述乳糖单独存在和葡萄糖、乳糖共存两种情况下乳糖操纵子基因表达的调节过程。
乳糖操纵子的结构组成：含有三个结构基因；一个操纵序列o和启动序列p以及分解物激活蛋白（或CAP）结合位点；编码阻遏蛋白的调节基因i。
调节过程：乳糖单独存在使转运入细胞产生的半乳糖，作为诱导剂结合阻遏蛋白使其变构与操纵序列分离，基因开放，此时CAP发挥正性调控作用，Lac操纵子被诱导表达，细胞利用乳糖；葡萄糖、乳糖共存时，乳糖操纵子基因被半乳糖诱导开放，但由于葡萄糖的存在，cAMP 浓度降低，失去了CAP的正性调控，乳糖操纵子基因不能表达，表现为细胞优先利用葡萄糖。
2.以β肌球蛋白基因的克隆与表达为例，阐述基因工程的主要步骤(可画图加以说明)①目的基因的获取;②克隆载体的选择和构建;③外源基因与载体的连接;④重组DNA导入受体菌;⑤重组体的筛选;⑥克隆基因的表达RT-PCR肌球蛋白基因连接目的基因和载体Western-blot鉴定筛选表达阳性菌落的目的蛋白，提取纯化鉴定3.已获得人体某一细胞总mRNA,欲从该mRNA中克隆某一基因，且将该目的基因在大肠杆菌中表达，以获得该基因表达的蛋白质。
请写出利用基因工程方法获得该目的基因表达的蛋白质的步骤以及鉴定该目标蛋白的方法。
、将该mRNA逆转录获得cDNA → 以cDNA为模板进行目标基因PCR扩增，且在引物两侧设计酶切位点→ PCR扩增产物双酶切→ 与载体连接，构建重组体→ 重组体导入宿主细胞→重组体的筛选→克隆基因的表达→ 用western blot方法鉴定该重组蛋白。
4.DNA复制如何保证其保真性①遵守严格的碱基配对规律②聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能③复制出错时DNA-pol I的及时校读功能5.为什么野生型P53蛋白被冠以“基因卫士”的称号?P53基因定位于17号染色体p13，有11个外显子，转录2.8kb mRNA，编码蛋白P53，是核内磷酸化蛋白。
2–δδct公式原理
2–δδct公式原理
2-ΔΔCt（2-ΔΔCt method）是一种常用于基因表达分析的相对定量方法。
它是基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术的数据分析方法，用于比较不同样本之间的基因表达水平差异。
该公式的原理如下：
1. Ct值，Ct值是荧光定量PCR实验中，检测到荧光信号超过背景噪音的阈值周期数。
Ct值越小，说明目标基因的起始量越高。
2. ΔCt值，ΔCt值是相对表达量的计算，表示目标基因的Ct 值减去参考基因的Ct值。
参考基因通常是在不同样本中表达稳定的基因。
3. ΔΔCt值，ΔΔCt值是比较不同样本之间的基因表达水平差异的计算，表示目标样本的ΔCt值减去参考样本的ΔCt值。
ΔΔCt值越小，说明目标基因在目标样本中的表达水平相对较低。
4. 2-ΔΔCt值，2-ΔΔCt值是将ΔΔCt值转化为相对表达量的计算。
它表示目标样本的相对表达量相对于参考样本的相对表达
量的倍数。
如果2-ΔΔCt值为1，表示目标样本和参考样本的表达量相等；如果2-ΔΔCt值大于1，表示目标样本的表达量高于参考样本；如果2-ΔΔCt值小于1，表示目标样本的表达量低于参考样本。
通过使用2-ΔΔCt公式，可以相对定量地比较不同样本之间的基因表达水平差异，而不需要绝对定量的标准曲线。
这种方法在生物医学研究中广泛应用，特别是在基因表达调控、药物研发和疾病诊断等领域。
需要注意的是，2-ΔΔCt方法的前提是基因的放大效率在不同样本中是相似的，并且参考基因在各个样本中的表达稳定。
因此，在使用该方法时，选择合适的参考基因和进行合适的实验设计非常重要，以确保结果的准确性和可靠性。
抗病毒蛋白
抗病毒蛋白（12种）(Antiviral protein)摘要：病毒进入机体后，能刺激人体的巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞产生干扰素。
干扰素具有广谱抗病毒作用，是抗病毒免疫中重要的蛋白质，它能诱生抗病毒白蛋白来阻止新病毒的产生。
但在机体内还存在着其它很多种具有抗病毒作用的的蛋白质，在抗病毒免疫中发挥重要的作用。
本文就主要介绍了其它种类的抗病毒蛋白。
关键字：抗病毒蛋白;作用机制Abstract: After the virus enters the body, wich can stimulate macrophages, lymphocytes and cells to produce interferon.which is the important proteins that can induce an antiviral albumin to prevent the generation of new viruses with broad-spectrum antiviral activity. However, in vivo there is a w variety of other proteins that having antiviral activity and play an important role in anti-viral immunity.This article introduces the other types of anti-viral proteins.Key Word: antiviral protein; mechanism of action一、干扰素（Interferon,IFN）1、干扰素的分类病毒进入机体后，能刺激人体的巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞产生干扰素。
干扰素具有广谱抗病毒作用。
根据干扰素产生的来源和结构不同，分为I型干扰素（IFN-α和IFN-β）和II型干扰素（IFN-γ）。
荧光定量PCR数据分析
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
2 -δδct 相对定量法
2 -δδct 相对定量法
2 -δδct相对定量法是一种常用的基因表达定量方法。
它使用实时荧光定量PCR（qPCR）技术来测量基因的表达水平，并相对于参考基因或对照样品进行比较分析。
在这种方法中，首先需要选择一个合适的参考基因，该基因应具有在实验条件下稳定的表达水平。
然后，通过qPCR测量感兴趣的基因和参考基因的Ct值（阈值循环数）。
Ct值是表示当荧光信号达到特定阈值时样品中的目标基因或参考基因的PCR循环数。
接下来，计算相对表达量的差异（2-ΔΔCt）。
ΔCt是目标基因Ct值减去参考基因的Ct值，表示目标基因与参考基因的相对表达水平差异。
2-ΔΔCt为ΔCt的对数转化，表示目标基因在不同样品之间的相对表达量差异。
通过使用2-δδct相对定量法，研究人员可以相对定量地比较不同样品中的基因表达水平，例如，在实验组与对照组之间比较基因表达差异。
这种方法广泛应用于生物医学研究和基因功能研究等领域。
2’-5’寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的活化及抗病毒作用研究进展
2’-5’寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的活化及抗病毒作用研究进展摘要】目的2’-5’寡聚腺苷酸合成酶(2’-5’oligoadenylates synthesis,OAS)是一种干扰素诱导产生的抗病毒蛋白(antiviral protein,AVP)。
OAS在机体的抗病毒免疫过程中发挥着重要作用。
在信号传导中，OAS通过介导细胞内信号转导而发挥抗病毒作用，对多种RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用。
活化的OAS发挥对病毒RNA的水解作用，以阻止病毒复制。
OAS蛋白具有极大的临床应用价值和广阔的研究前景。
近年来国内外关于OAS的研究成果不断出现，现就OAS的研究现状进行综述【关键词】OAS 信号转导病毒【Abstract】2’-5’oligoadenylates synthesis(OAS)is a kind of interferon inducedprotein,antiviral antiviral protein(AVP).OAS antiviral immune process plays an important role.In signal transduction of OAS,mediated by intracellular signalling the role.In recent years,the research results about the OAS at home and abroad,we reviewed the research status of OAS.【Key words】OAS Signal transduction virus病毒入侵机体后，可诱导机体产生多种细胞因子(CK)，CK在机体抗病毒免疫中起着非常重要的作用，在CK中，干扰素(IFN)是一种人类和动物细胞在对各种病毒等因素刺激的应答中产生的具有多种功能的一类蛋白或糖蛋白，具有广谱抗病毒及免疫调节等作用[1]。
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相对荧光定量法检测人体2',5'-寡聚腺苷酸合成酶相对表达水
平
张晶;王芳;陆春燕;孙诗琪;孙家鹏;邢美杰;章良弼;付洁;宋海峰
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2018(029)001
【摘要】目的:建立相对荧光实时定量法(RT-QPCR 2-△△Ct),考察聚乙二醇化重组人干扰素α2b注射液临床Ⅰ期试验中给药后外周全血中2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-OAS)相对药前点的相对表达水平变化.方法:根据GenBank中查询的2',5'-OAS的序列构建质粒,并纯化定量作为方法标准品,制作标准曲线及验证样品,考察该方法的准确度及精密度;采用RT-QPCR 2-△△Ct方法,以个体药前样品为对
照,GAPDH为内参,比较考察给予聚乙二醇化重组人干扰素α 2b注射液(受试品160 μg/人)与阳性对照药派罗欣(180 μg/人)后外周血中2',5'-OAS mRNA表达变化倍数;同时,基于ELISA方法对2',5'-OAS蛋白浓度表达进行分析.结果:2',5'-OAS 标准曲线有相对较好的线性(R2=0.99),cDNA 2',5'-OAS与2',5'-OAS标准品的PCR产物熔解曲线温度一致,说明引物特异性好.2个剂量组中mRNA表达水平均在20 h左右达到峰值,其中160 μg剂量组中峰浓度较高.ELISA检测血清中2',5'-OAS浓度无明显变化.结论:与传统蛋白水平检测的ELISA方法相比,RT-QPCR 2-△△Ct灵敏度较高,可以作为一种检测外周全血中生物标志物的替代方法,以给予药效学研究的临床支持.
【总页数】6页(P78-83)
【作者】张晶;王芳;陆春燕;孙诗琪;孙家鹏;邢美杰;章良弼;付洁;宋海峰
【作者单位】军科正源(北京)药物研究有限责任公司,北京102206;军科正源(北京)药物研究有限责任公司,北京102206;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,安徽合肥230088;军科正源(北京)药物研究有限责任公司,北京102206;军科正源(北京)药物研究有限责任公司,北京102206;军科正源(北京)药物研究有限责任公司,北京102206;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,安徽合肥230088;军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,蛋白质药物国家工程研究中心,北京102206;军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,蛋白质药物国家工程研究中心,北京102206【正文语种】中文
【中图分类】Q502;R96
【相关文献】
1.应用实时荧光定量PCR相对定量法检测毛皮动物细小病毒载量 [J], 仝明薇;易立;程世鹏
2.实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择 [J], 李雅楠;郝玉宾;张志;戴二黑
3.4种肿瘤标志物mRNA相对表达水平的检测及其在肿瘤化疗疗效评估中的初步应用 [J], 沈奕;史伟峰;姜庆波;马锦洪;柳楠楠;
4.荧光定量PCR检测干旱胁迫下长春花Crlea基因的相对表达(英文) [J], 祖元刚;聂明珠;房思良;于景华;郭晓瑞
5.蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR 检测 [J], 唐博;冯永淼;付本懂;曹贵方
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