引物设计原则(最全汇总)
引物设计的几点重要原则
引物设计的几点重要原则引物设计是一项关乎实验成功与否的重要环节，它不仅有助于提高实验的可重复性和准确性，还能够节约时间和资源。
以下是引物设计的几个重要原则：1.特异性：引物设计的首要原则是确保引物的特异性。
引物应该能够与目标序列的唯一区域进行特异性结合，而不会与其他非目标序列发生非特异性结合。
为了实现特异性，可以通过保守区域的选择和引物长度的设计来提高引物的特异性。
此外，还需使用类似BLAST等的软件来检测引物的特异性。
2.稳定性：引物的稳定性是保证实验成功的另一个关键因素。
引物应具有足够的稳定性，以便在实验条件（例如温度、盐浓度）的变化下保持结构完整性。
引物的稳定性可以通过咪唑核苷（例如dI、dG和dT）的引入来提高，并且应避免使用GC含量过高或过低的引物。
3.避免二聚体形成：引物应避免在自身之间或与其他引物之间形成二聚体（即引物之间的双链结构），以免影响PCR扩增的效果。
为了避免二聚体形成，可以使用软件工具对引物进行设计，并确保引物之间的序列不会发生相互碱基配对。
4.合理的Tm值：引物的Tm值（即熔解温度）对PCR扩增的效果有直接影响。
合理选择引物的Tm值，能够使引物在PCR反应温度下有效结合，但又不容易形成非特异性结合。
通常，引物设计时会考虑引物前10个核苷酸的碱基组成、GC含量和引物长度，以预测引物的Tm值。
5.避免交叉杂交：引物设计时需要避免引物之间的交叉杂交，以免影响PCR扩增的特异性和准确性。
为了保证引物不会发生交叉杂交，可以使用软件工具进行引物设计时模拟引物之间的相互作用，并确保引物之间的序列不会相互配对。
6.引物长度和位置：引物的长度和位置是影响PCR扩增效率和特异性的重要因素。
通常，引物长度在18-30个核苷酸之间是理想的选择。
引物的位置应位于目标序列的两端，以便在扩增时产生一个特定大小的目标序列。
此外，最好在引物设计时避免选择在基因中存在多态性位点的引物。
7. 引物设计软件的应用：引物设计软件在引物设计和评估中扮演着重要的角色。
引物设计的几点重要原则
引物设计的几点重要原则引物设计是指设计引物（primers）用于特异性扩增目标DNA序列的反应体系，是分子生物学中常用的重要技术。
引物设计的质量直接影响DNA扩增的效果和结果的准确性。
下面是几点引物设计的重要原则：1.特异性：引物设计的首要原则是确保引物的特异性，即保证引物只能特异性地结合目标DNA序列，而不与非目标DNA序列结合。
为了达到特异性的引物设计，可以通过特异性检测和非特异性检测来筛选合适的引物。
特异性检测可以通过引物与目标DNA序列的杂交反应来验证引物的特异性；非特异性检测则通过引物与非目标DNA序列的杂交反应来验证引物的非特异性。
2.合适的长度和GC含量：引物的长度和GC含量对引物的特异性和扩增效率都有很大的影响。
通常情况下，引物的长度应该在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低下，而过长的引物可能导致特异性降低；GC含量应该控制在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致扩增效率降低。
3.避免自互补和互补结构：在引物设计中应避免引物自身的互补和互补结构，以尽量减少引物之间的相互作用和自身的片段结合。
自互补可能导致引物自身结构稳定，而互补结构可能导致引物之间的非特异性结合，从而干扰扩增反应的进行。
4.避免引物之间的交叉杂交：引物之间的交叉杂交可能导致非特异性扩增产物的形成，影响扩增结果的准确性。
为了避免引物之间的交叉杂交，需要确保引物在体系中的浓度适当，并且没有共同的序列特征。
5.考虑引物的反应条件：在引物设计过程中，还需要考虑引物的反应条件，如反应体系的温度和离子浓度等。
引物的反应条件需要确保引物与目标DNA序列的特异性结合和扩增能够在所设定的反应条件下进行。
6.引物的设计应尽量使用标准碱基序列：标准碱基序列即DNA序列的A、T、C、G四种碱基。
在引物设计中，应尽量使用标准碱基序列，避免使用非标准碱基或特殊碱基。
综上所述，引物设计的几个重要原则包括特异性、合适的长度和GC 含量、避免自互补和互补结构、避免引物之间的交叉杂交、考虑引物的反应条件以及使用标准碱基序列等。
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则1。
引物的长度一般为15—30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加.3。
引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A.另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4。
引物序列的GC含量一般为40-60％,过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大。
5。
引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳.Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method）.6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3'端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应.7。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4。
5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5—3方向的,Tm之间的差异最好控制在1度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
引物的设计原则
引物的设计原则
引物是在PCR反应中起到扩增目标DNA序列作用的重要组成部分。
引物的设计质量直接影响PCR扩增的效率和准确性。
下面是引物设计的几个原则：
1. 引物长度：一般来说，引物长度应该在18-24bp之间。
过短的引物会导致特异性不足，容易出现非特异性扩增产物；过长的引物则会降低PCR反应的效率。
2. 引物Tm值：Tm值是指引物与模板DNA杂交时形成稳定双链结构所需要的温度。
合适的Tm值可以保证引物在PCR反应中充分杂交，从而提高扩增效率和特异性。
一般来说，引物Tm值应该在55-65℃之间。
3. 特异性：为了避免与非目标DNA序列发生杂交，引物设计时必须考虑其特异性。
可以通过比对目标DNA序列和非目标DNA序列来选择具有区别性的区域进行设计。
4. 末端修饰：在某些情况下，末端修饰可以提高PCR反应的效率和特异性。
例如，在5'端加上磷酸基团或者3'端加上羟基基团可以提高引物与模板DNA的亲和力，从而提高扩增效率。
5. 避免引物间的二聚体：引物之间的二聚体会影响PCR反应的特异性和效率。
因此，在设计引物时需要避免引物之间形成稳定的二聚体。
6. 引物浓度：在PCR反应中，引物浓度也会影响扩增效率和特异性。
一般来说，合适的引物浓度应该在0.1-1μM之间。
以上是引物设计的几个原则，通过合理地设计引物可以提高PCR反应的效率和特异性。
引物设计原则
引物设计原则引物是在PCR（聚合酶链式反应）中起到引导DNA复制的作用的两段短单链DNA序列。
设计引物是PCR实验的重要一环，引物的合理设计直接影响PCR反应的效果。
下面是一些引物设计的原则和技巧，供参考：1.周知序列：在设计引物之前，首先要确保目标DNA序列已经被充分了解。
这意味着你需要知道起始点和终止点，以及任何可能的变异、重复或剪接事件。
同时，需要避免引物与非目标序列的互补匹配。
2.引物长度：通常情况下，引物长度应在18到30个核苷酸之间。
过短的引物可能导致不特异性扩增，而过长的引物会增加PCR的难度。
3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是指引物在PCR反应中的温度。
引物的Tm值应该在50到65摄氏度之间，确保引物可以特异性地结合目标DNA的序列。
可以使用在线计算工具计算引物的Tm值。
4.GC含量：引物的GC含量对引物的稳定性和特异性有直接的影响。
通常情况下，引物的GC含量应在40%到60%之间。
高GC含量的引物可以提高特异性和稳定性，但可能会导致引物的熔解温度过高。
5.引物间配对：引物一般是成对使用的，因此两个引物之间应该相互配对。
引物间的配对应该没有重复、交叉或自身互补的现象。
此外，引物间的距离应该适中，可以通过距离目标DNA序列两端50到150个核苷酸来确定。
6.引物的互补性和自身互补性：引物应该避免与非目标序列互补匹配。
此外，引物本身也应该避免自身互补匹配，以免引起二次结构。
7.避免引物间的重复和重叠：引物之间的重复和重叠可能导致PCR扩增产物的重复和回退。
为了避免这种情况，可以使用在线工具来检查引物之间的相互性。
8. 引物设计软件：为了更准确、更高效地设计引物，可以使用一些专门的引物设计软件。
常用的引物设计软件有Primer3、NCBI Primer-BLAST和IDT OligoAnalyzer等。
总结：引物设计是PCR反应的关键一步，合理的引物设计直接影响PCR反应的成功与否。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
引物设计的原则
引物设计的原则①总原则：引物序列应具有高度的特异性，与非扩增区的同源性越低越好。
②引物的长度：引物中与模板互补的序列应该为15~25个核苷酸长度，上下游引物长度的差别不宜大于3bp。
③引物中四种碱基含量及分布：引物中G+C含量最好在40% ~ 60 %/40% ~ 75%之间，四种碱基应尽可能随机分布，避免出现多聚嘌呤、多聚嘧啶和二核苷酸重复序列。
引物内部特别是引物末端不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列，以避免形成发夹结构。
④上下游引物之间的互补性：上下游引物之间特别是3´应避免出现互补序列。
作为一条经验性的规律，一条引物上不应该含有3个连续的与另一条引物互补的核苷酸。
⑤解链温度（Tm）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃。
扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，以保证扩增产物在每个PCR循环可以有效的变性。
⑥引物3´末端的碱基：如果可能的话，每个引物的3´末端碱基应为G或C,然而并不推荐使用3´端有……NNCG或NNGC序列的引物/一般PCR反应中，引物3´端的碱基最好不选A。
引物3´端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3´端。
⑦向引物的5´端添加限制性酶切位点、启动子或GC夹子等序列：如果要向引物的5´端添加限制性酶切位点，引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基。
另5´端应再加2～4个无关碱基（保护碱基），以确保产物的酶切效果。
/5´端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
⑧当针对CDNA模板设计引物时，上游和下游引物最好结合到不同外显子的区域，这样很容易把来源于CDNA的的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分开。
酶切位点的选择：应选择载体上有而目标基因内无的酶切位点，两酶切位点在载体上的距离最好大于6bp。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在分子生物学研究中，用于扩增目标DNA序列的两个引物的设计。
好的引物设计是成功进行PCR反应的关键之一、下面是引物设计的基本原则：1.引物长度：引物长度一般在18-24个碱基对左右，太短容易引起非特异性扩增，太长则可能导致引物无法与目标序列完全匹配。
2.引物的GC含量：引物的GC含量一般在40-60%之间，太低则可能导致引物无法与目标序列形成稳定的双链结构，太高则可能导致引物与非特异性目标序列发生杂交。
3.引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm是指引物与目标序列在溶液中解链的温度。
引物设计时应保证所设计的两个引物的Tm值相似，一般相差不超过2-3摄氏度。
这样可以保证引物在PCR反应中同时结合于目标序列。
4.引物的特异性：引物设计时必须确保引物与目标序列的特异性，即引物在基因组中只与目标序列互补匹配，不与其他非目标序列发生杂交。
为了提高引物的特异性，可以使用生物信息学工具如BLAST进行引物的序列比对和分析。
5.引物的结构：引物设计时应注意引物的序列结构。
首先要避免引物的自身二级结构，特别是避免引物的自身二聚体形成，可以使用在线工具进行预测和评估。
另外，引物的末端最好是链末端，避免引物形成环状结构。
6.引物的位点选择：在设计引物时，应选择位于目标序列上的独特位点作为引物扩增的位点。
这样可以确保引物扩增出的产物是目标序列，而不是其他类似的序列。
7.引物的序列设计：引物设计时应避免序列中出现连续的重复碱基序列，避免过多的GC或AT连续存在。
此外，引物设计时还可以考虑在引物的序列中加入特定的限制性内切酶位点，方便后续分子克隆和分析。
总结起来，引物设计的基本原则包括引物长度、GC含量、Tm值、特异性、结构、位点选择和序列设计。
良好的引物设计是成功进行PCR反应的前提之一，能够提高扩增效率和特异性，并且避免产生非特异性扩增产物。
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引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2. 下载基因序列到Vector NTI；3. 找到所需安装载体序列；4. 将基因序列的CDS高亮标记；5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。
酶切位点一般是6bp 的回文序列；6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM 值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。
注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率；10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。
不过重复的序列也不能太多，以免移码；12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。
2011年10月18日左洁1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2. 2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′- 脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3. 3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。
引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4. 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5. 5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6. 6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV- 1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。
引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
7.Hairpin 发卡结构8.如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应9.二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。
引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚10.体扩增使11.Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始12.【1】引物的长度以15－30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。
13.【2】】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+C含量在40％－60％之间，若G+C含量太低，可在5"端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5"端加上一些A或T。
14.【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3"端互补形成引物二聚体，避免在引物的3"端有3个G或3个C成串排列，3"端的末位碱基最好选T、C、G,而不选A，也有建议在引物的两端用1－2个嘌呤碱基。
15.【4】尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。
Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。
而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。
（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。
因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。
）16.【5】引物的3’端要与模板严格配对，而5’端碱基没有严格的限制，只要与模板DNA结合的部分足够长，其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。
17.【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。
也要考虑引物设计处模板的特异性。
引物设计原则1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。