三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用

三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用摘要：体外细胞培养技术已成为细胞生物学、药学、毒理学、干细胞、系统生物学和新药创制等领域必不可少的工具。

传统平板细胞培养方法使细胞单层生长于二维环境，不能产生体内的细胞外基质屏障。

且细胞表型也异于原代细胞，而三维细胞培养技术通过模拟机体内细胞生长的生理微环境，利用各种支架或设备来促进细胞生长和组织分化，产生具有合理形态结构和功能性的组织，具有细胞培养直观性和条件可控性的优势，故其在再生医学应用方面有着非常大的发展潜力。

本文从干细胞、血管再生、器官移植、以及组织修复等方面综述了近期三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用，并介绍了三维细胞培养技术在功能性生物材料方面研究中的作用，有助于对功能性生物材料的表面改性设计研究。

关键词：三维细胞培养技术；再生医学；干细胞；血管再生；器官与组织修复随着生物医学的发展．疾病的治疗方式已得到了极大改进。

但组织器官严重损伤后修复缓慢，或由于创伤过大而致组织器官无法修复，使得再生医学成为当今生物医学的关注焦点和研究热点。

体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境对再生医学研究至关重要，而传统的单层平面培养的细胞无论是在形态，结构和功能方面都与在体内自然生长的细胞相去甚远．由于无基质支持，细胞仅能贴壁生长。

从而失去其原有的形态特征及生长分化能力，而三维细胞培养技术以其能为细胞和组织创造一个均衡获取营养物质、进行气体交换和废物排出的理想生理场所。

又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官等特点，广泛应用于再生医学的研究[ ]。

目前，三维细胞培养方式发展迅速，包括皮氏培养瓶、灌注小室、搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器、以及微重力旋转生物反应器等培养方式。

其中微重力旋转细胞培养技术因其特有的微重力环境，使细胞与细胞、细胞与载体的交联度、沉降力、机械力、压力等发生相互作用、相互制约，模拟了近似生物体内细胞的生长状态和微环境，在再生医学领域应用中备受关注.。

除再生医学以外，三维细胞培养技术也常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究1 三维细胞培养技术在再生医学应用中的优势三维细胞培养技术使用三维支架或设备细胞提供类似体内生长环境的支架或基质．建立细胞问及细胞与胞外基质问的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构，既保留了体内细胞微环境的物质结构基础．又实现了细胞培养的直观性及条件可控制性，便于研究人体生理、病理状况，以及预防或疾病的治疗。

三维细胞培养技术主要通过体内和体外两种方式。

实现其在再生医学中的应用，两者皆采用从机体获得功能细胞。

细胞体外扩增培养后，与三维结构的生物材料按一定比例混合。

前者是直接植入体内的病损部位，利用机体天然的生长环境．扩增分化．并分泌细胞外基质，最后形成所需的组织器官。

而体外方式为达到相同的生长环境，需人工建立一个近似的生理生长环境，因此，体外三维细胞培养技术有着独特的优势：(1)易形成接近于机体的活体组织，可对病损组织的形态、结构和功能进行合理重建；(2)与体内培养相比，体外培养更安全，呵直接观察生成组织的形态结构，检测其功能是否正常，为再生器官和组织的研究，提供更安全有效的物质基础。

2 三维细胞培养技术在再生医学上的应用2．1 干细胞分化、生长骨髓间充质干细胞又称为骨髓基质干细胞．为造血干细胞的生长、分化及自我更新提供重要的微环境，具有多向分化潜能。

能分化为造血实质细胞和基质细胞，以及肌肉细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等各种类型细胞，但由于其分化效率低限制了其在临床治疗方面的应用。

最近，Wang 等采用光刻微图案化技术．建立了维球形细胞培养系统，研究表明该系统能调控骨髓问充质干细胞分化的相关基因表达，使骨髓间充质干细胞的分化效率提高了5倍，为程化维细胞培养分化效率机制的研究，以及再生医学和药物选择研究提供依据。

此外，定向测控骨髓问质干细胞分化，一直以来都是再生医学中的难点。

Mauck等从时空角度检测功能性细胞外基质基因的转录情况，观察动态刺激对定制压缩式生物反应器系统中骨髓间充质干细胞三维生长的影响，研究表明该系统显著提高骨髓问充质干细胞中功能性糖胺聚糖的转录和沉积，提示该系统具有促进骨髓间充质干细胞定向分化的作用。

由于可变的通畅率，材料利用率，免疫排斥等原因，极大限制了组织工程血管在心血管疾病移植治疗中的应用，但采用自身胚胎干细胞培养的组织工程血管则能降低移植治疗带来的特异性免疫排斥。

Abilez等[H 通过建立模拟生理脉动条件下二三维培养体系。

使未分化的小鼠胚胎十细胞成功生长，为基于自身胚胎干细胞的组织T程血管构建提供了基础。

同样，利用旋转生物反应器培养在三维支架上的小鼠胚胎干细胞也显示，同常规平面培养、静态三维培养相比，动态刺激能显著提高三维支架上细胞外基质相关蛋白的表达、以及生长因子和细胞粘附因子等相关基因的表达．表明三维旋转培养对小鼠胚胎干细胞的造血分化能力具有显著的促进作用。

因此，这些三维细胞培养技术大大提高了胚胎干细胞在再生医学中的应用。

但由于胚胎干细胞固有的分化能力，使维持其未分化状态、保持其正常的活力和形态成为再生医学研究的重点和难点。

为模拟体内免疫隔离的生理微环境．Zhang等采用微胶囊三维细胞培养技术培养未分化小鼠胚胎干细胞，细胞活力检测和组织学观察、以及细胞内Oct4基因的表达．均表明微胶囊中的小鼠胚胎干细胞呈未分化状态，且维持了正常的生长形态，显示该方法便于胚胎干细胞的大量培养和优化。

2．2 血管组织再生目前。

血管组织再生研究已广泛在再生医学的临床应用中开展。

血管的建立包括血管生成和血管新生。

血管生成是在生长因子作用，由造血干细胞增殖、分化形成新的血管组织，而血管新生则是在已有血管网络结构基础上，经由生长因子作用下内皮细胞的迁移、增殖、分化，最后出芽形成新的血管网络结构El7]。

因此，血管组织再生需要细胞、细胞外基质和信号系统共同参与完成，然而在体外很难维持正常的细胞外基质和信号系统．即具备合适的pH值，氧分压，细胞接种密度，生长因子和营养物质。

而三维细胞培养技术可为血管组织工程提供成熟化的新生血管技术、高效的生物材料和可行的干细胞应用。

三维细胞培养技术可使细胞呈立体生长，更接近于体内生长模式。

为血管生长模拟了类似于体内的三维空间，并在生长因子的作用下诱导细胞发生出芽、增生、迁移或分化等一系列变化，对于评估各种影响因素对血管生成更具有实际应用价值。

作者采用由美国宇航局(NASA)开发的旋转式细胞培养系统RCCS(rotarycell culture system)，研究脐静脉内皮细胞在不同材料微载体上的生长情况。

观察到生长的细胞因随机变化的重力矢量而悬浮，从而在培养液中形成连续的自由落体状态．经由生长因子作用内皮细胞在不同材料微载体上发生了立体的迁移、增殖，其中尤以表面覆以明胶的微载体生长较好．同时又加入高剂量和极低剂量的过氧化氢刺激细胞，通过定量和细胞形态学的鉴定检测，结果显示高剂量过氧化氢具有很强的细胞毒性，而低剂量过氧化氢则能显著提高细胞的增生能力，提示氧化应激可能参与了血管内皮的再生，有助于功能性复合生物材料在表面改性、血管再生、组织修复等方面的设计。

2．3 器官与组织修复2．3．1 肝脏修复目前，由于肝脏疾病仍占据疾病发生率与死亡率的前位，但可供移植的肝脏组织的缺乏，使肝脏疾病的治疗无法有效开展。

SchmelzerE 等利用具有独立中空纤维膜系统的三维多室生物反应器．培养人原代肝实质和非实质细胞，由于该系统可体外模拟体内营养物均匀交换、氧气供给的生理环境．结果显示所培养的实质细胞团块内可见复杂的胆管网络和祖细胞样的细胞集落．并检测到血管样结节部位的分裂细胞中含肝细胞生长因子．肝细胞和胆管细胞中有肝细胞生长因子的活化因子及肝细胞生长因子受体c—Met的表达．为临床上体外培养肝细胞，用于肝脏移植提供依据。

此外，三维细胞培养以其利于肝细胞生长、扩增、分化，以及近似体内环境等优点，使其成为人工肝理想的再生模式_加_。

2. 3．2 心脏修复尽管目前临床上已可成功阻止和减轻心脏疾病，但心脏器质性损害的恢复仍是一个难题。

然而对具有分化能力心肌干细胞的研究，为再生医学提供潜在的细胞来源，但其在临床应用中的分化问题仍难以解决。

Hosseinkhani等采用微米和纳米级的三维细胞培养系统培养心肌干细胞，观察到心肌干细胞在三维灌流培养系统中粘附、增殖的潜伏期显著高于二维静止培养，提示三维细胞培养技术为心肌细胞的再生，以及心脏疾病的治疗提供了有效的途径。

魏国峰等为实现小鼠胚胎干细胞的生长、分化，构建了小鼠胚胎干细胞．胶原复合体的三维培养体系，结果显示小鼠胚胎干细胞在该三维培养体系内生长、增殖状态良好，且能建立起细胞连接，并经诱导后细胞自发性分化为具有表达心肌蛋白cTn—T等特异性蛋白的心肌细胞。

另外，随着针对心血管修复的细胞治疗技术发展。

用于心脏血管再生的心血管前体细胞培养也倍受关注。

Karuparthi等采用模拟细胞外基质的三维细胞培养技术．观察内皮细胞生长培养基对心外膜前体细胞基因表达和形态变化的作用．结果显示一b~l-膜前体细胞表达了内皮和平滑肌细胞的标志基因．并生成细胞内液泡、聚集形成多细胞导管结构，超微结构也进一步证实心外膜前体细胞形成了内皮细胞特异细胞器WP(Weibel—Palade)小体，表明这种三维细胞培养技术促进了一b~l-膜前体细胞的分化，为心脏保护的细胞治疗提供了依据。

2. 3. 3 骨组织构建骨骼系统是一个动态的、矿化的管状网络结构，是神经、血管以及肌肉组织的结构支架。

目前，成熟的软骨细胞和胚胎干细胞的三维培养技术已被广泛开展．并用于骨组织工程中软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板的损伤再生。

因此，骨组织丁程的最终目标是利用载体诱导骨细胞发生迁移，并在载体上沉积为骨基质，在结构与功能上达到天然组织的状态，其中骨细胞在载体上的固化显得尤为重要。

Smith等利用光敏感脂质体一藻酸盐凝胶对骨源细胞进行三维固化培养．观察到细胞被较好地定位于凝胶中，并保持良好的活力，显示该三维固化方法可促进骨源细胞在理想位置的生长，利于骨组织工程支架和人工骨组织的研究。

唐少锋等通过将松质骨和骨皮质固定于j维支架表面．制备了特殊三维支架脱钙骨基质载体结构，用来培养脂肪干细胞，结果显示了细胞在可降解脱钙骨基质的表面和空隙内均能良好地粘附生长。

并能增殖和分泌细胞外基质。

此外，由于氧气和营养物在三维基质中分布的不均，导致三维支架培养的骨组织自外向内出现不均一的增殖和分化情况，从而阻碍了骨组织工程的利用Volkmer等通过比较静态和动态灌注三维细胞培养方法对前成骨细胞生长的影响，观察到同静态三维培养相比，动态灌注生物反应器能明显提高三维支架中心区的前成骨细胞生长，改善支架内部氧气梯度的分布，降低氧浓度不均而致细胞死亡，显示了动态三维细胞培养技术能显著促进工程化的骨组织的生长。