全血胆碱酯酶活性测定
6,胆碱酯酶活性测定
实习三有机磷经皮染毒对全血胆碱酯酶活性的影响（一）目的和意义1、学习经皮染毒技术，掌握急性经皮毒性试验的方法。
2、观察有机磷经皮肤吸收后对机体的急性毒性作用。
3、掌握全血胆碱酯酶活性的测定方法及原理。
（二）仪器1．解剖剪刀、弯剪、镊子、灌胃针。
2．恒温水箱(37±0.5℃)。
3．离心机。
4．分光光度计，10mm比色皿。
5．血红蛋白吸管（20μl）；刻度吸管（5.0ml，2.0ml，1.0ml）；离心管（10ml）；容量瓶（10ml，100ml）；试管（10ml）、烧杯等。
（三）试剂1．受试物：有机磷（由指导教师自定）；溶剂，根据受试物的理化性质选定。
2．磷酸盐缓冲液(1/15m mol/L，pH7.40)：称取9.07g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解并稀释至1000mL(甲液)；称取23.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，用水溶解并稀释至1000mL(乙液)。
取甲液19.2mL与乙液80.8mL混合即得。
3．生理盐水：氯化钠8.5g/L。
4．硫代乙酰胆碱(ASCh)：称取72.3mg ASCh(生物试剂)溶于生理盐水中，并稀释到10mL；置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
5．5，5′－联硫代－双－2－硝基苯甲酸(DTNB)溶液：称取19.8mg DTNB，滴加磷酸盐缓冲液(4.2)，搅拌，直至完全溶解，溶液透明(大约加2mL)，再用生理盐水(4.3)稀释至10mL，置冰箱中保存，临用时以生理盐水稀释10倍。
出现黄色即弃用。
6．抑制剂毒扁豆碱：取1mg左右柳酸毒扁豆碱，溶于0.5mL生理盐水(4.3)，临用时配制，严防污染其他试剂及器材。
7．1m mol/L谷胱甘肽标准溶液：精确称取3.07mg还原型谷胱甘肽用水溶解，移入10mL容量瓶中，稀释至刻度。
此液1mL相当于1μmol谷胱甘肽。
因其易被氧化，应于用时配制，水必须先经煮沸去氧冷却后使用。
（四）实验步骤1．实验动物的选择实验动物可选择健康豚鼠或家兔，也可用大鼠。
全血胆碱酯酶活性测定教案
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三、试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4· 12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3· 6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7μmol/mL乙酰胆碱
全血胆碱酯酶活性的分光光度 测定方法
----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996
一、原理
• 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 • 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。 在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱 的量计算胆碱酯酶活性。
四、采样、运输和保存
• 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即进行测定。 • 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保 存一周。
五、分析步骤
管号 乙酰胆碱标准 应用液(ml) 磷酸盐缓冲液 乙酰胆碱含量 (umol) 0 0 1.0 0 1 0.1 0.9 0.35 2 0.2 0.8 0.7 3 0.3 0.7 1.05 4 0.4 0.6 1.4 5 0.5 0.5 1.75 样品 A 血 0.02 ml 0.98ml 对照 B 血 0.02 ml 0.98ml
全血胆碱酯酶活性的测定之欧阳家百创编
全血胆碱酯酶活性的测定欧阳家百（2021.03.07）——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min+1.0mL水 37℃水浴 30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴 30minD 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min +1.0mL水37℃水浴 30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min；2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min；3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B C D吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs==3.149μmolXs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；A：以B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
胆碱酯酶的测定
胆碱酯酶（CHE）的测定
一、原理：血清及组织中CHE使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，未被水解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。
二、试剂：
1、试剂一：溶液60ml×1瓶，室温保存。
2、试剂二：乙酰胆碱粉剂×1支，-20℃保存，稀释液5ml×1瓶，4℃保存。
80μmol/ml 乙酰胆碱底物贮备液的配制：将一支乙酰胆碱碱粉剂倒入5ml稀释液中即成，4℃。
8μmol/ml 乙酰胆碱应用液的配制：贮备液：试剂=1：9稀释。
3、试剂三：甲粉剂×1支；乙液30ml×1瓶；丙液30ml×1瓶；室温保存。
试剂三应用液的配制：每次测试前将甲粉倒入乙液中，充分摇匀，根据需要量将甲乙混合液与丙液等量混合，充分混匀，配成试剂三应用液，现用现配。
4、试剂四：溶液30ml×1瓶，室温保存。
5、试剂五：溶液20ml×1瓶，室温保存。
6、试剂六：粉剂×1瓶，稀释液30ml×1瓶，测试前将稀释液倒入粉剂中，充分混匀，避光
4℃冷藏。
测各管吸光度值。
四、计算：
1、定义：血清中CHE的计算：每毫升血清在37℃和底物作用20分钟，分解1μmol乙酰胆
碱为1个活力单位。
2、计算公式：
血清中CHE活力。
全血胆碱酯酶活性的测定
全血胆碱酯酶活性的测定——羟胺三氯化铁法实验目的1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤与酶测定的临床意义。
2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的采集。
实验原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。
未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。
颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。
在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和材料蒸馏水盐酸溶液(1＋2)碱性羟胺溶液磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)三氯化铁溶液氯化乙酰胆碱标准液分光光度计10mL比色管漏斗恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头血色素吸管采样、运输和保存用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min+1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minB 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30minC 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30minD 空白管 1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30min水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：1.加入4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇2min；2.加入2.0mL 盐酸溶液，充分振摇2min；3.加入2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果表1-1 520nm波长下样品的吸光度样品编号 A B CD吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000结果计算①计算酶活性的绝对值带入得： Xs=7538.0299.0003.0538.0⨯-+=3.149μmol Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL ·37℃·30min)；A ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处样品管的吸光度值； B ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处对照管的吸光度值；C ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处标准管的吸光度值。
胆碱酯酶活力测定的中毒标准
胆碱酯酶活力测定的中毒标准
胆碱酯酶（ChE）活力测定可以用于检测有机磷农药、神经毒剂等对胆碱酯酶的抑制作用，从而判断暴露者是否中毒。
根据WHO的建议，胆碱酯酶活力的下限可以作为暴露标准的参考。
下面是常用的胆碱酯酶活力参考值：
胆碱酯酶活力正常参考值：在25℃下，健康人血浆中胆碱酯酶活力的正常范围为3300~12,000 U/L。
有机磷农药中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的30%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的10%以下，表示中毒程度较重。
神经毒剂中毒参考值：血浆中胆碱酯酶活力下降到正常值的50%以下，表示中毒程度较轻；下降到正常值的20%以下，表示中毒程度较重。
需要注意的是，由于胆碱酯酶活力受多种因素影响，如个体差异、性别、年龄等，因此，这些参考值仅供参考，具体应根据实际情况进行判断。
同时，在实际应用中，还应结合其他检测方法和中毒症状进行综合分析。
全血胆碱酯酶活性的测定讲课讲稿
蒸馏水
盐酸溶液(1＋2)
碱性羟胺溶液
磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)
三氯化铁溶液
氯化乙酰胆碱标准液
分光光度计
10mL比色管
漏斗
恒温水浴箱，控温±0.5℃
采血针头
血色素吸管
采样、运输和保存
用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步骤
A样品管+0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min
C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。
②计算酶活性的相对值
Y= =197
Y—酶活性的相对值，%；
Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
Xc—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)
吸光度0.299 0.003 0.538 0.000
结果计算
①计算酶活性的绝对值
带入得：Xs= =3.149μmol
Xs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
A：以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；
B：以试剂空白为参比的在波长520nm Nhomakorabea对照管的吸光度值；
讨论
1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19±0.398μmol；因3.149μmol在3.19±0.398μmol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。
2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变化有关。
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶活性测定方法
胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性测定方法主要有以下几种常用的方法：
1. 利用酶促反应产生的色素变化测定：
(1) 比色法：将胆碱酯酶底物乙酰胆碱与碱性溴化镉等试剂反应，生成黄色产物，利用比色计或分光光度计测定产物的吸光度，间接测定胆碱酯酶活性。
(2) 荧光法：将胆碱酯酶底物与荧光染料反应，使底物和产物之间发生荧光变化，利用荧光光谱仪测定荧光强度，间接测定胆碱酯酶活性。
2. 利用电化学方法测定：常用的是反应器中使用碳电极或银电极，利用底物和产物之间的电位差变化测定胆碱酯酶活性。
3. 利用放射性同位素标记测定：将底物或产物标记上放射性同位素，通过测定放射性同位素的放射性强度，间接测定胆碱酯酶活性。
4. 利用质谱法测定：将底物和产物分离并通过质谱仪测定其质荷比，间接测定胆碱酯酶活性。
需要注意的是，不同的测定方法适用于不同的实验目的和样本类型，具体的选择应根据实验需求和设备条件来确定。
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注意事项
• 本法检测限为2.4μmol/L，线性范围为2.4～ 1000.0μmol/L。 水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次， 干燥后备用。 • 取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤 压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例 过多，会使结果偏低。 • 加碱性羟胺和盐酸(1＋2)时，必须严格掌握振 摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。
• 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= Xs/ Xc
• 式中：Y—酶活性的相对值，%；
• Xs—被测血样中酶活性的绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)；
• Xc—正常人血中酶活性绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)。 Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃· 30min)
四、采样、运输和保存
• 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即进行测定。 • 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保 存一周。
五、分析步骤
管号 乙酰胆碱标准 应用液(ml) 磷酸盐缓冲液 乙酰胆碱含量 (umol) 0 0 1.0 0 1 0.1 0.9 0.35 2 0.2 0.8 0.7 3 0.3 0.7 1.05 4 0.4 0.6 1.4 5 0.5 0.5 1.75 样品 A 血 0.02 ml 0.98ml 对照 B 血 0.02 ml 0.98ml
水浴 37℃ 5 分钟 乙酰胆碱 0.5ml 37℃30 分钟 羟胺 2 ml 羟胺 2ml 振摇 3 分钟 乙酰胆碱 0.5 ml 37℃30 分钟
碱性羟胺 1：2 HCl 100g/L FeCl3
2 ml
振摇 3 分钟 1 ml 1 ml 振摇 1 分钟
振摇 3 分钟
摇匀 离心后 520nm 比色
2、标准曲线法
• 被水解乙酰胆碱的吸光度＝C-(A-B)。
• 被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准 曲线，得相应的被水解乙酰胆碱(μmol)。此 值是0.02mL血液在37℃30min反应条件下， 胆碱酯酶的活性绝对值。
• 正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常 的80% • 轻度有机磷农药中毒为正常的50% ~70% • 中度中毒为30%~50% • 重度中毒多在30%以下 • 慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在 50%以下 • 酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶 活性严重抑制但症状却很轻微。
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三、试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4· 12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3· 6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7μmol/mL乙酰胆碱
全血胆碱酯酶活性的分光光度 测定方法
----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996
一、原理
• 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 • 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。 在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱 的量计算胆碱酯酶活性。
• 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪 色，必须控制在20min内比色完毕。若大批 样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液， 否则会有较大误差。 • 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸 光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 • 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需 做标准管。标准管读数在同一比色计上应 保持恒定或仅有较小的变动。 • 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区 正常人全血胆碱酯酶活性为基准。
六、计算
1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱 吸光度=B-A。 • 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙 酰胆碱的量，此值为0.02ml血37℃30分钟反应条 件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 • 式中：Xs——水解乙酰胆碱的浓度， μmol(0.02mL·37℃· 30min)； • A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管 的吸光度值； • B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管 的吸光度值。