全血胆碱酯酶活性的测定

蒸馏水

盐酸溶液（1 ＋2）

碱性羟胺溶液

磷酸盐缓冲液（PH= 7.20）三氯化铁溶液

氯化乙酰胆碱标准液分光光度计

10mL比色管

漏斗

恒温水浴箱，控温土0.5 C 采血针头

血色素吸管

全血胆碱酯酶活性的测定

羟胺三氯化铁法

实验目的

1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。

实验原理

血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

试剂和材料

采样、运输和保存

用血色素吸管，取指血20卩L,注入比色管中（事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液），立即进行测定。

实验步骤

A样品管+0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37 C水浴5min ------ >

+1.0mL乙酰胆碱应用液37 C水浴30mi n

B对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37 C水浴5min -——>

+1.0mL 水 37 °C水浴 30mi n

C标准管1.0mL磷酸盐缓冲液37 C水浴5mi n + 1.0mL乙酰胆碱应用液 37 C水浴30mi n

D空白管1.0mL磷酸盐缓冲液37 C水浴5min +1.0mL 水

——37 C水浴30mi n

水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作:

1. 加入4.0mL碱性羟胺溶液，充分振摇2min ;

2. 加入2.0mL盐酸溶液，充分振摇 2min ;

3. 加入2.0mL三氯化铁溶液，充分振摇；

4. 滤纸过滤，520nm比色。

实验结果

带入得: Xs= 0.538 0.003 0.299

7=3.149 卩 mol

0.538

Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，卩 mol(0.02mL • 37 30min);

A ： 试剂空白为参比的在波长 以

520nm 处样品管的吸光度值;

B: 以试剂空白为参比的在波长

520nm 处对照管的吸光度值; C: 以试剂空白为参比的在波长

520nm 处标准管的吸光度值。 Y=

3149

100=197 1.60 表1-1 520nm 波长下样品的吸光度

样品编号 A B C D

吸光度

0.299 0.003 0.538 0.000

结果计算

①计算酶活性的绝对值

②计算酶活性的相对值

Y —酶活性的相对值， %

Xs—被测血样中酶活性的绝对值, 卩mol(0.02mL • 37 30min);

Xc —正常人血中酶活性绝对值，卩mol(0.02mL • 37 C • 30min)。Xc=1.60卩

mol(0.02mL • 37 30min)

讨论

1. 由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19 ± 0.398卩mol ;因3.149卩mol在3.19 ±

0.398卩mol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。

2. 各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变化有关。

3. 采血要迅速，防止凝固及氧化;振摇要充分，同时防止液体溅出;比色时有以 D 管调零。

注意事项

1. 采血前应准备好试管，提前加入磷酸盐缓冲液;

2. 采血时严格消毒，用过的采血针放入利器筒中，棉签放入垃圾桶中，不可混放;

3. 准确控制水浴的温度和时间，否则会影响实验结果;

4. 加入三氯化铁显色后， 20 min 内比色。