月季的花药离体培养

特点：1 明显缩短育种年限 2 后代植株都为纯合子。
一、被子植物的花粉发育 雄蕊
花丝 花药：囊状结构，内有很多花粉
花粉 花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形 成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。
被子植物花粉的发育要经历：
四分体时期、单核期和双核期等阶段。
造孢细胞
小孢子四分体
单核
双核
花粉母细胞 （小孢子母细胞）
⑦花药培养时间
一般月季的花药培养时间选在5月初到5月的中 旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态 及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功 率。
月季花药培养时的花粉粒最好是（ A、四分体时期 B、单核居中期
C）
C、单核靠边期
2、培养基：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
D、二核或三核花粉粒
花药培养基所采用的培养基可能因植物的不同 而有所变化小麦为N6培养基，马铃薯、月季 为MS培养基，油菜为B5培养基。
4、鉴定和筛选 在花药培养中，特别是通过愈伤组 织形成的花粉植株，常常会出现染 色体倍性的变化（主要原因是营养 细胞核和生殖细胞核融合造成的）。
5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点：
项目 相同点 不同点
植物组织 离体的植物组 外植体为体细胞，染色 培养技术 织经脱分化形 体数无需加倍。 成愈伤组织， 花药培养 再分化成丛芽， 取材为花药，培养的为 诱导出根，然 单倍体幼苗，植株弱小， 技术 后进行移栽。 高度不育，必须用秋水 仙素处理，使染色体加 倍，恢复正常植株的染 色体数，而且为纯种。
细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成） ②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前， 生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子， 这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个 精子。 ③两个精子和一个营养核的基因型相同。
1、关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（ BD ） A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的 B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果 C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核 期、双核期等阶段 D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移 到细胞中央
⑤单核期花药的挑选 为了挑选到单核期的花药，通 常选择完全未开放的花蕾。盛 开的或略微开放的花，都不宜 选作实验材料。 ⑥选择完全未开放花蕾的 原因 完全未开放的花蕾，可挑 选到单核期的花药，菌少、 易消毒
⑦为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？ 花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药， 给材料的消毒带来困难。
花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于 载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检 （花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）
（二）材料的消毒
1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒 2、无菌水清洗 3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分 4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟 （质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
2、焙花青—铬钒法 ①卡诺氏固定液的配制方法 将无水酒精与冰醋酸按体积比为3 ：1的比例混匀
②焙花青—铬钒溶液的配制方法
将5g铬明矾[K2SO4Cr2(SO4)· 24H2O]加入 90ml蒸馏水中，溶解后加入0.1g焙花青，混匀 并加热至沸腾，煮沸5分钟后冷却至室温，过滤， 加蒸馏水定容至100ml。 ③染色操作
有丝分裂
减数分裂
4个小孢子
1个小 孢子
（单细胞花粉粒）
花粉粒 （双核）
花 粉 粒
小孢子四分体
单核
双核
花粉母细胞 （小孢子母细胞）
有丝分裂
减数分裂
4个小孢子
营养细胞核
1个小 孢子
营养细胞
花粉粒 （双核）
生殖细胞核
2个精子
花粉是单倍体的生殖细胞
花粉囊
花药
成熟 花粉
小孢子母细胞
8个精子
小孢子
花粉粒 （双核期）
③花药培养时期的选择 一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞 一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最 适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期
④其它时期选择的缺点
选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易 破碎； 选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动， 又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核 期的花药。

二、产生花粉植株的两条途径
取决：培养基中的激素种类及浓度配比
体细胞胚（胚状体）： 在组织培养过程中，某些体细 胞在形态上转变为与合子发育成的 胚非常相似的结构，发育过程亦与 合子胚类似，被称为体细胞胚（胚 状体）。
三、影响花药培养的主要因素
能否成功： 1、材料的选择 2、培养基的组成
（ MS培养基+不同比例的植物生长调节激素） •此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等
5、无菌水冲洗3～5次
花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态
（三）接种和培养
1、剥取花药 在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药 注意： ①勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产 生愈伤组织。 ②要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药 不利于愈伤组织或胚状体的形成。 2、接种
立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花 药7-10个。
2、醋酸洋红法 ①醋酸洋红法染色机理
醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细胞内有染色 体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性 染料着色染成红色 。
②醋酸洋红的配置
将体积分数45％的醋酸100ml煮沸，缓缓加入1g 洋红，在加热回流8h，冷却至50℃，过滤即可。
③染色操作
花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊 柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细 胞核被染成红色）
2、其他因素 亲本植株的生长条件、材料的低温预处理 以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响
月季花药培养时的花粉粒最好是（ C ）
A、四分体时期 B、单核居中期
C、单核靠边期
D、二核或三核花粉粒
五、实验操作
（一）材料的选取 选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉 是否处于适宜的发育期。 1、方法 ①最常用的方法有醋酸洋红法 ②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙 花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成 蓝黑色。
课题2
月季的花药培养
花中皇后—月季又称“月月红”，自然花期5至11月
主要知识
（一）、被子植物的花粉发育和产生 花粉植株的两条途径 （二）、月季花药离体培养的操作过 程 （三）、影响花药培养的因素
知识回顾
单倍体育种的过程？
正常植株（2N） 花药离体培养（N） 植株（2N） 单倍体植株（N） 秋水仙素处理， 使染色体翻倍
1、材料的选择： ⑴不同种类植物的诱导成功率不同。 ⑵同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成功 率有直接影响。 ⑶合适的花粉发育时期：花期早期时的花药最佳。 ⑷选择最合适的花粉发育时期
①不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容易 破碎； ②不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给材 料消毒带来困难； ③挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花蕾， 菌少，易消毒。
1、材料的选择
选材是否成功是花药培养成功的关键 ⑴不同种类植物的诱导成功率不同。 ⑵同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导 成功率有直接影响。 ⑶合适的花粉发育时期：花期早期时的花药 比后期的更容易产生花粉植株
②选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率 的重要因素
因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养 产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中， 只有某一个时期对离体刺激敏感。
3、培养 ①培养条件：温度控制在25℃左右，不需要 光照。幼小植株形成后才需要光照。 ②培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药 开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。 长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养 基上，以便进一步分化出再生植株。
③注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个 花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开 裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培 养基上，否则这些植株将很难分开。
小孢子母细胞 2N
（ N
2 ）个精子
（ 减数 ）分裂
（ 有丝 ）分裂 生殖 ）细胞 （ N （ 营养 ）细胞 N
（ ）时期 小孢子四分体 N
单核（ 中 ）期 N
花粉管 ）细胞核 （ 生殖）细胞核 （ N N 双核期
（ 有丝 ）分裂 单核（ 边 ）期 N
注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管