小鼠脾细胞悬液制备
gentleMACS实验操作步骤中文
gentleMACS™操作步骤1.背景信息在许多实验中，需要用到单细胞悬液，如用MACS®技术分选细胞时，要想获得高纯度和回收率的话，单细胞悬液就很重要。
德国美天旎生物技术有限公司开发的gentleMACS™分离器能够提供优化的程序，用于从不同的组织中获取单细胞悬液。
这些组织包括小鼠脾脏，肝脏，肺脏，脑组织等。
使用C管，能够在一个密闭的系统中进行全自动的组织分离，可以保证组织操作的无菌，以及能够同时处理2个组织样本。
2. 分离小鼠脾脏的操作步骤2.1 需要的试剂和仪器●gentleMACS 分离器●gentleMACS C 管(# 130-093-237)●细胞滤器，如30 μm n尼龙滤网（Pre-Separation Filters# 130-041-407)●缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.2,含0.5% 牛血清白蛋白(BSA), 和2 mMEDTA (不推荐使用含Ca2+ or Mg2+的缓冲液)2.2 步骤▲如制备的单细胞悬液用于细胞培养，所有的步骤必须在无菌条件下获得。
▲一只小鼠脾脏的重量约为80–120 mg (BALB母鼠, 6–7 周龄).1. 将小鼠脾脏转移到gentleMACS C 管中，按照脾脏的数量加入缓冲液:1–2 个小鼠脾脏: 3 mL3–4个小鼠脾脏: 6 mL5–6 个小鼠脾脏: 9 mL2. 拧紧C管盖子，倒置在gentleMACS 分离器上▲注意: 必须确保组织块在转子区域3. 开机，选择合适的分离程序：1–2 个小鼠脾脏: m_spleen_01.3–6个小鼠脾脏: m_spleen_04.4. 运行gentleMACS 程序m_spleen_01. 或m_spleen_04.5. 程序结束后，从gentleMACS 分离器中取出C管6. (可选) 以300×g 室温下离心2分钟。
7. 去除分离的组织块，将细胞悬液通过一个预分选滤器（1-2个脾脏），该预分选滤器放置于15mL管子中。
改良的脾细胞悬液制备方法的探讨
第1期农垦医学第41卷脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。
鉴于脾脏的功能丰富，由其制备的脾细胞悬液在科学研究和临床应用研究方面也很广泛，但目前报道的脾细胞悬液制备方法大多数是机械研磨分散法。
本研究探讨一种改良的脾细胞悬液制备方法，旨在为进一步的脾细胞悬液应用提供方法学指导，以期能更好地应用于改良的脾细胞悬液制备方法的探讨贺亚玲1崔林1邢建新2李玲1唐慧1刘欢1陈雪玲2（1.石河子大学医学院形态实验中心，新疆石河子，832002；2.石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室，新疆石河子，832002）【摘要】目的：通过与常规制备脾细胞悬液方法比较，探讨一种具有机械损伤度小,活细胞比例高，收集细胞较多的脾细胞悬液制备方法。
方法：常规取小鼠脾脏，放入小平皿内，用带有弯曲针头的注射器在含有1～2mL PBS 的小平皿中刮出脾细胞；再用5mL和2mL注射器依次吹打混匀，洗涤脾细胞，计数。
常规脾细胞悬液制备方法为机械研磨分散法。
结果：采用改良的脾细胞悬液法使活细胞比例在98%以上，脾细胞收集较多，体重25g左右的昆明系小鼠脾细胞收集量能达到1.6×108/mL，脾细胞相对较完整且能用于进一步的研究。
结论：改良的脾细胞悬液制备方法较常规的方法操作简便，且具有机械损伤度小，脾细胞相对较完整的优点，值得推广和应用。
【关键词】脾细胞悬液；制备方法；改良中图分类号：R-332文献标识码：AStudy on Preparation of Modified Spleen Cell SuspensionHE Ya-ling1,CUI Lin1,XING Jian-xin2,LI Ling1,TANG Hui1,LIU Huan1,CHEN Xue-ling2（1.Center of Morphology Experimental，Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002；2.Department of Medicine Pathogenic Biology and Immunology,Shihezi University School of Medicine,Xinjiang Shihezi，832002）【Abstract】Objective：Compared with the conventional method for preparing spleen cell suspension，a method for preparing spleen cell suspension with small mechanical damage,high proportion of living cells，more spleen cells collection is explored.Methods：The mouse spleen was routinely taken,placed in a small dish，and spleen cells were scraped off in a small dish containing1to2mL of PBS using a syringe with a curved needle.Then spleen cells were blewed and mixed with5mL and2mL syringe,spleen cells were washed,counted.Conventional preparation of spleen cell suspension is a mechanical grinding dispersion method.Results：The improved spleen cell suspension method works better，and has the advantages of small mechanical damage，more than98%of living cells and more spleen cells collected,and the collection amount of spleen cells of Kunming mice weighing25g achieve1.6×108/mL, it can be used for further research.Conclusion：The preparation method of the improved spleen cell suspension is simple and convenient to operate compared with the conventional method,spleen cells are relatively complete advantages，it can be worth promoting and application.【Key words】Spleen cell suspension；Preparation method；Improvement基金项目：石河子大学教育教学改革项目（SJ-2018-15）；石河子大学混合式教学项目资助（BL2016061）。
脾脏单细胞悬液制备
脾脏单细胞悬液制备
脾脏单细胞悬液制备是一种常用的实验方法，用于分离和检测脾脏中的单个细胞。
操作步骤如下：
1.准备器材：取一只小鼠脾脏，注射器、离心管、冷暗培养皿、离心机、搅拌器等。
2.将小鼠脾脏取出，放入冷PBS缓冲液中，将其清洗干净。
3.将脾脏组织放在冷暗培养皿中，用注射器注入10毫升消化液，搅拌10分钟。
4.将消化液滤过40μm滤网，离心10分钟。
5.去除上清液，用10毫升PBS缓冲液重悬细胞，计数并存放于离心管中。
6.将细胞进行下一步实验操作。
注意事项：为避免对细胞质量的影响，操作过程中保持所有物品的清洁度和冷却度，并严格控制操作时间。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
免疫细胞分离及NK活性测定
取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
抗体生成细胞实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解抗体生成细胞的分离和培养方法。
2. 学习观察和记录抗体生成细胞的形态变化。
3. 掌握抗体生成细胞活性检测的基本技术。
二、实验原理抗体生成细胞是指能够产生抗体的细胞，通常为B淋巴细胞。
在抗原刺激下，B淋巴细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。
本实验通过分离小鼠脾脏中的B淋巴细胞，体外培养并观察其形态变化，以及检测其产生抗体的能力，来研究抗体生成细胞的特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：抗原、抗体、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数板、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠脾脏细胞分离- 处死小鼠，取出脾脏。
- 将脾脏放入无菌培养皿中，用无菌剪刀剪碎。
- 加入Ficoll分层液，室温静置30分钟。
- 吸取中层细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次。
- 计数细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
2. 细胞培养- 将细胞悬液加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中。
- 将细胞悬液分装至培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2天更换一次培养基。
3. 形态观察- 在显微镜下观察细胞形态变化，记录细胞生长情况。
4. 抗体生成细胞活性检测- 收集细胞培养液，离心去上清。
- 将细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬，加入抗原，37℃孵育1小时。
- 加入抗体，37℃孵育30分钟。
- 加入底物，观察颜色变化。
- 记录抗体生成细胞活性。
五、实验结果1. 细胞形态观察- 在培养过程中，细胞逐渐从单层排列变为多层排列，细胞体积增大，形态趋于扁平。
2. 抗体生成细胞活性检测- 加入抗原和抗体后，部分细胞出现颜色变化，说明这些细胞能够产生抗体。
六、实验讨论1. 本实验成功分离和培养了小鼠脾脏中的B淋巴细胞，并观察到了细胞形态的变化。
2. 抗体生成细胞活性检测结果表明，部分细胞能够产生抗体，证实了实验的成功。
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小鼠脾细胞悬液制备
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备：
1．小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；3．在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400 u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。
6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。
7、试取胸腺
注：一般6-8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。
2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
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