qRT-PCR-生物分析检测技术

第二节 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR仪、技术 原理及应用
一、实时荧光定量PCR仪 二、实时荧光定量PCR的技术原理
1. 2. 3. 4. 5. 定量与常规的差别 荧光扩增曲线 荧光阈值和CT值 熔解曲线 标准曲线
6. 何为实时？ 7. SYBR Green I 的工作原理 8. Molecular Beacons（发夹型杂交探针）的 工作原理 9. TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理 10. 多色多通道技术应用——基因表达分析 11. 内标技术介绍 三、 实时荧光定量PCR技术的应用介绍 1. 医疗方面 2. 研究方面 3. 其它方面
CT值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的
5. 标准曲线
CT值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关 系：起始拷贝数越多， CT值越小。 利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表CT值， 纵坐标代表起始拷贝数 的对数（如图3所示）。 因些只要获得未知样品 的CT值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起 始拷贝数。
（发夹型杂交探针）的工作原理
原理：荧光谐振能量传递（FRET） 环与目标序列完全配对 茎由互补配对的序列组成 变性: 产生非特异性的荧光 延伸: 没有荧光
分子 Beacons是一种在靶DNA不存在时 形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。 在此发夹结构中：位于分子一端的荧光 基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。 • 在此结构中，荧光基团被激发后不是产生 光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过 程称为荧光谐振能量传递（FRET）。
SYBR GreenⅠ的特点
① 由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板
②
③ ④
⑤
不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较 低。 利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通 过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体， 因而可以区分非特异扩增。 此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料 结合，因此SYBR GreenⅠ的检测灵敏度很高。 但是，由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相 结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错 误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。 通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非 特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一 性有助于更准确地分析SYBR GreenI。
Opticon 实时荧光定量 PCR仪
荧光检测 热循环仪 光色: 蓝色光 均一性: ±0.4°C 染料: FAM, SYBR Green I, Molecular beacons TaqMan Probes 精确性: ±0.3°C 激发光波长： 450-495nm 发射光波长: 515-545nm 升降温速率: 最 高3°C/秒. 灵敏度: <5nM的荧光素 温度梯度: 有 检测范围: 100 - 108 拷贝 容量: 96样品 反应管: 0.2mL反应管& 96 孔板 操作系统: Windows NT
CYBR GreenI 的应用范围及优缺点
起始模板浓度定量 融解曲线分析：可区分单一产物、变异产物、 多种产物和（或）引物二聚体 基因型分析 使用方便：不必设计复杂的引物 没有序列特异性：可以用于不同的模板 便宜 灵敏 与非特异性产物结合
8. Molecular Beacons
分子Beacons不同于SYBR Green的一个 优点就是它特异性地检测感兴趣的目标 DNA。 • 通过精心设计分子Beacons和优化反应 条件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非 常高，可用于单核苷酸多态性（SNPs） 的检测。 • 但是，为检测某一特定的目标DNA，每 一个探针都必须单独仔细地设计。 分子Beacons是美国纽约公共健康研究 学会的技术专利。
当有靶序列存在的时候，靶序列和分子信 标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺 旋结构，导致分子信标的构象改变，干的 部分打开，荧光基团与猝灭基团分开，二 者之间的能量转移终止； • 在有相应的单色光激活时，荧光基团发出 荧光。荧光强度与溶液中靶序列的多少成 正比，通过检测荧光的强度就可以计算出 靶序列的量。 • Beacons与模板配对后：分子Beacons的构 象改变使得荧光基团与淬灭剂分开；当荧 光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
This technology is very sensitive in that it is able to detect single copies of genes and requires very little starting material across a wide spectrum of conditions. The system monitors PCR at each cycle of a reaction, and estimates the cycle when the reaction reaches log phase increments (when the most useful quantitative information about the sample is available) Quantitation can be "relative" to an internal standard such as a housekeeping gene, or "absolute" when compared to a standard curve generated from known concentrations.
二、实时荧光定量PCR的技术原理 1.定量与常规的差别
常规PCR技术：对PCR扩增反 应的终产物进行定量及定性分析 定量PCR技术：对PCR扩增反 应中每一个循环的产物进行定量 及定性分析
SYBR Green I 定量原理
确定初始模板的浓度: 初始DNA量越多, 荧 光达到某一值（域值）时所需要的循环数 越少 Log浓度与循环数呈线性关系：根据样品 扩增达到域值的循环数就可计算出样品中 所含的模板量
实时荧光定量PCR：其反应体系中，引入了 一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行， PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等 比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光 强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩 增曲线。
2.荧光扩增曲线
荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信 号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期 。 •荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 •平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关 系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起 始DNA拷贝数。 •只有在荧光信号指数扩增阶段：PCR产物量 的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我 们可以选择在这个阶段进行定量分析。
① 目标特异性探针 ② 5’为荧光素，3’为淬灭剂 ③ 模板和探针杂交 ④ 延伸: 聚合反应，Taq酶切下5’端荧光 素出现荧光
TaqMan (水解型杂交探针)的 应用范围及优缺点
定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP分析
对目标序列有很高的特异性,特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比，设计相对简单 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析
Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Core Facility Using TaqMan and the Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division 7700 Sequence Detector
6. 何为实时？
试剂方面： 如何做到相对荧光强度反应的是PCR 产物的相对量；如何做到相对荧光强度反应的是特 定PCR产物的相对量； 仪器方面： 如何测定相对荧光强度
Opticon 实时荧光定量实PCR仪试剂 工作原理
工作原理 哪一步可以观察到荧光信号？ 变性；复性；延 伸 应用
7. SYBR Green I 的工作原理 SYBR Green I结合到双链DNA的小沟部 • SYBR Green I染料只有和双链DNA结合后才 发荧光。 • SYBR GreenⅠ的最大吸收波长约为497nm， 发射波长最大约为 520nm。 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染 料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后， 发射强荧光信号; 而不掺入链中的SYBR染料分 子仅有微弱荧光信号背景，从而保证荧光信号 的增加与PCR产物的增加同步。 • 变性：无荧光信号，未结合SYBR Green I Dye 通过产物的Tm值来确定产物
分子信标的结构：是一个具有茎－环 （loop-stem）结构的寡核苷酸探针，通常 有25～35个核苷酸，两端分别标上一个荧 光基团和淬灭基团。 • 分子Beacons的茎环结构中，环的部分用于 与靶序列杂交（与目标序列互补），通常 由15～30个核苷酸组成，要求与靶序列杂 交后能形成与探针－靶序列双螺旋有关的 反式构型，并使干的部分打开，尽量得使 荧光基团和淬灭基团分开足够的距离。 • 一般茎（干的部分）一般5-8个核苷酸长 （碱基对），并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端，一般连在5’端； 而淬灭基团一般连在3’端。 • 通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸 （DABCYL）作为淬灭基团。 分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于 在复性温度下： • 模板不存在时形成茎环结构； • 模板存在时则与模板配对。 自由状态时，分子信标呈发夹型结构，荧光 基团和淬灭基团靠得很近，二者之间发生能 量转移（FRET和直接能量转移），荧光基团 的能量被淬灭基团吸收并以热的形式散发， 荧光几乎完全被猝灭。
Molecular Beacons 的应用范围及优缺点
定量起始模板浓度 基因型分析 鉴定产物 单核苷酸多态性（SNP）检测