微生物染色技术
微生物染色技术
简单染色法革兰氏染色法抗酸染色法死菌鉴别染色法芽孢染色法姬姆萨染色法细菌染色法活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）染料：染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。
染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。
碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。
微生物染色原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。
细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。
染色种类:简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
操作步骤1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。
革兰氏染色:原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
几种常用的微生物染色方法汇总
·健康科学·几种常用的微生物染色方法汇总黄波因微生物细胞比较小且透明，在普通的光学显微镜下不容易进行观察。
染色以后微生物细胞会与背景形成比较鲜明的色差，从而可以清楚地观察到微生物的形态，有利于鉴别、强化细化或细胞组分与周围环境之间产生的反差，方便利用普通光学显微镜对微生物细胞进行观察的简便方法。
一、微生物染色原理因微生物细胞含有大量的水分，所以对光线的吸收、反射及水溶液之间的差异不明显，机体属于无色、透明样，且与周围的环境背景之间也没有明显的反差，在普通的光学显微镜下不容易进行识别，所以必须对微生物进行染色，经过染色以后，菌体会与背景有明显色差的形成，才能更加清楚地观察到其形态与结构。
微生物细胞主要是有由蛋白质、核酸等两性电解质以及其他的化合物所组成，所以会表现出两性电解质的性质。
而两性电解质又兼具了碱性基、酸性基，在酸性溶液当中，会解离出含有碱性基呈碱性带正电；在碱性溶液当中，会解离出酸性基呈酸性带负电。
经过测定后，细菌等电pH值在2~5之间，所以在中性、碱性或是偏酸性的溶液中，细菌的等电点均小于上述中溶液的pH值，因此，细菌是带负电荷，容易和带正电荷的碱性染料相互结合，所以应用碱性染料色的比较多。
此外，微生物体内的各种结构的结合力与染料不同，所以可以使用各种染料对微生物的结构分别进行染色，便于观察。
二、染料的种类与选择染料可以分为2种类型：①天然染料，包含胭脂虫红、地衣素、石蕊、苏木素等，大部分都是从植物中所提取的，成分较为复杂。
②人工染料，又被称为煤焦油染料，大部分都是从焦煤油中所提取的，属于苯的衍生物。
大部分染料都属于带色有机酸或是碱类，有的也与有机溶剂相溶，为了使其能够在水中易溶，通常会把它们制作成盐类。
染料按照电离后的染料离子，所带的电荷性质，将其可分为以下几种类型。
（一）酸性染料该类染料进行电离以后，染料离子带负电，例如伊红、刚果红、苯胺黑等，可以和碱性的物质进行结合，成为盐；当培养基为糖类，而分解产酸的时候会使pH值下降，同时细菌所带的正电荷会增加，这时应该选择酸性染料，微生物容易被染色。
微生物基本染色方法
基本染色方法1.染色准备：染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水 1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
2.几种基本染色方法2.1 革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
2.1.1结晶紫溶液A液：结晶紫2g95％乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2.1.2碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
2.1.3 脱色液：95％乙醇。
2.1.4复染液A. 贮存液：沙黄 2.5g95％乙醇100mlB. 应用液： A液 10ml蒸馏水 90ml2.1.5染色方法：A．涂片经火焰固定，加结晶紫液染30s，清水冲去染液。
B．加碘液染30s，水洗。
C．加脱色液，不时摇动约5～10s，至无紫色脱落为止，水洗。
D．加复染液，染30s，水洗。
E．干后镜检。
3、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
染厚涂片时，须掌握复染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法：①碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法(我们使用的方法)。
常用染色技术(食品微生物课件)
革兰氏阳性菌——紫色 革兰氏阴性菌——红色
一、细菌革兰氏染色
点样
革
初染
兰
染
媒染
色 步
骤
脱染
复染
二、酵母菌死活鉴别
结果观察：
蓝色酵母：死 无色酵母：活
知识点：细菌革兰氏染色技术
情境：细菌染色与形态观察 任务：细菌革兰氏染色
课程：食品微生物技术
细菌革兰氏染色技术
一、细菌革兰氏染色
革兰氏染色简介
一、细菌革兰氏一、细菌革兰氏染色
革兰氏染色
基本步骤： 涂片固定—— 结晶紫初染1min—— 碘液媒染1min—
知识点：酵母菌美蓝染色及死活鉴别
情境：酵母菌染色与形态观察 任务：酵母菌美蓝染色及死活鉴别
课程：食品微生物技术
酵母菌美蓝染色及死活鉴别
一、酵母菌美蓝染色
1.染色原理
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。 用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细 胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还 原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代 谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死 细胞和活细胞进行鉴别。
一、酵母菌美蓝染色
2.实验仪器与器材
1）菌种：普通酵母菌 2）染色液：0.1%美蓝染液。 3）器材：显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、接种环等。
一、酵母菌美蓝染色
3.实验内容
（1）制片 取0.1%美蓝染色液1滴于载玻片中央，用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀 ，染色2~3 min后加盖玻片。 （2）镜检 用低倍镜和高倍镜观察细胞形态。根据酵母菌是否染上蓝色区别细胞的死活 。 （3）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。
微生物常用染色法-PPT
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细菌染色的一般程序
涂片(干燥)---固定---染色---脱色---复染
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涂片制备
血液,分泌物,排泄物,穿刺液和液体培养物,直接 在载玻上作薄涂片. 固体培养基上的菌落或菌 苔的制片,用接种环取1 环9g/L氯化钠溶液置载 玻片中央.再用无菌接种环取少量的培养物在 氯化钠溶液中磨匀,涂成人1CM*1CM大小的涂 面.置室温下自然干燥或火慢慢烘干.
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涂片见G+球菌，呈葡萄状排列
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涂片见G+球菌，呈链状排列
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染色原理:
最广泛接受观点认为与细菌细胞壁结构及化学 组成有关. G+菌细菌壁结构致密,肽聚糖层厚, 脂质含量少,形成结晶紫_碘复合物.脱 色过程 中,虽然溶解细菌壁脂质成分形成小孔.脱水作 用使细胞壁收缩又 构成屏障,阻止结晶紫—碘 复合物被乙醇溶出,细菌保持紫色.G-菌细菌壁 疏松,肽聚糖层较薄,脂质含量高,乙醇溶解脂质, 经复染细菌呈红色.
– 复染色法 用两种或以上的不同颜色的染料进行 染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成 不同颜色
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大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
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革兰染色
– 细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液1min,清水冲去染液. – 加碘液媒染1min,水洗,甩干. – 用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30S,至无紫色洗落为止,水洗,
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染色原理
抗酸性染色细菌与细胞壁成分有关.分枝杆菌 细胞壁含脂质较多,其中主要成分是分枝菌酸. 决定抗酸性染色反应,用乙醚脱去分 分枝菌酸,则呈非抗酸染色性.
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剂.也可用加热法促进着色.
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脱色
使已着色的被染物脱去颜色.常用乙醇,丙酮等 作为脱色剂.脱色剂可以查出细菌与染料结合 的稳定程度,作为鉴别染色用.
微生物的染色原理
微生物的染色原理
微生物的染色原理在实验室中被广泛应用，以便观察和研究微生物的形态、结构和分布。
常用的染色方法包括革兰氏染色、抗酸染色和目标特异性染色等。
革兰氏染色是最常用的微生物染色方法之一。
它基于细菌细胞壁的特性，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
染色过程中，先通过紫色染料普鲁士蓝霜处理细菌细胞，使其呈紫色。
随后用碘酒金溶液进行固定，不易被冲洗掉。
然后使用乙醇洗去多余染料，并通过红色染料孔雀石绿进行反染，使革兰氏阴性细菌呈绿色。
抗酸染色用于分辨酸杆菌，如结核分枝杆菌和变形杆菌等。
这种染色方法基于酸性染料的特点，如琼红和文氏染料，能够着色酸杆菌。
染色过程包括涂片染色、定着、洗涤和固定等步骤，最终观察酸杆菌的红色或粉红色。
目标特异性染色常用于检测特定微生物或其特定组分。
例如，荧光染色可以利用荧光染料与微生物靶标结合，使其发出荧光信号；免疫染色可以利用抗体识别特定微生物蛋白质，再用染色剂标记抗体，显示出目标微生物的位置。
总之，微生物染色的原理是通过特定的染料与微生物结构或组分的相互作用，使其呈现出可视化的颜色或荧光信号。
这些染色方法对于微生物的鉴定、分类和研究具有重要的意义。
微生物的制片染色技术
微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。
至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。
细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。
注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。
简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。
此方法用于观察细菌外形及大小。
革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。
用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。
染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。
镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。
革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。
因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。
此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。
特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。
芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。
芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。
常用微生物染色方法
原理
一 通透性学说 二 等电点学说
三 化学学说
革兰氏阳性菌含有大量核糖 核酸镁盐，其可与结晶紫-碘 结合成大分子复合物，因而 不易被95％酒精脱色；而阴 性菌中此物质含量较少，因 而吸附染料量很少，分子量 也较小，故易被酒精脱色。
细菌涂片的制备
涂片：取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环 生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，取菌与生理 盐水磨匀，涂布成1cm×1cm大小区域的均匀薄膜，使 盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。 干燥：涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面 向上，置酒精灯火焰上半尺高处慢慢烘干。 固定：常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向 上，迅速来回通过火焰三次。
操作步骤 1、涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液用火 焰微热至出现蒸气约3分钟（防止染液蒸发干， 必要时可续加第一液数滴，水洗。 2、用3%盐酸酒精脱色约1分钟，直至涂片无色 或淡粉红色为止，水洗 3、再加复染液复染1分钟，水洗，干后镜检。 结果判断 抗酸杆菌呈红色，其他细菌及细胞 呈蓝色。
注意事项 1．抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加 标本涂片的厚度，发提高检出率。染厚涂片时， 须掌握复染时间，如果背景过深，会影响镜检。 痰标本找抗酸杆菌，应先高压杀菌，避免实验室 污染。 2．尿、粪中找到抗酸杆菌须作潘氏染色，排除 耻后杆菌，才能报告。 标本中找到抗酸杆菌，须作传染病报告。 3．离心应为3000转/分，30分钟。 4．涂片至少保留三个月。
注意点
⒈取菌量不可太多，涂片应均匀，否则影响染色结果 ⒉干燥时切忌高热，以免细菌变形 ⒊固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面 烧焦及玻片烧裂
固定的目的
杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色 改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内 使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染 料和水冲掉
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（六）革兰氏染色各步骤的要求
1、载玻片的要求
载玻片应清洁干净。 常规工作中可将载玻片清洗干
净后浸泡在95％酒精中，随 用随取。
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2、涂片的要求
滴一滴无菌水在载玻片中央， 准备涂片；或用接种环沾3-4 环无菌水，用于涂片。
无菌水不宜过多，否则后续的 干燥时间增多。
红色
2#
球状
紫色
结果判断 G-杆菌 G+球菌
报告：经镜检，该细菌为G-（革兰氏阴性） 杆菌。
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（五）操作注意事项
1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴生理盐 水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌
？ 膜宜薄。
2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 3、染色过程中勿使染色液干涸。 4、选用幼龄的细菌。
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（一）革兰氏染色流程
涂片 → 干燥 → 固定 → 染色 → 镜检
初染 → 媒染 → 脱色 → 复
结晶紫初染1min，水洗
染
碘液媒染1min，水洗
乙醇脱色20秒，立即水洗至无色
番红复染1min，水洗
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（二）革兰氏染色原理
革兰氏染色后镜检，显微镜下 观察发现，有些种类细菌呈红 色，有些种类呈紫色。
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5、涂片为什么要薄而均匀，不能过厚？
涂片过于浓厚，可能会脱色不 足，导致假阳性结果，菌量过 大也不利于菌体排列方式的观 察。
左下角，太厚而不能脱色
同理，不均匀也会在局部过厚， 颜色不一，难以判断。
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5、涂片为什么要薄而均匀，不能过厚？
过少可能难以观察到标本菌。
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一、单染色法
简单染色的基本程序： 涂片 → 干燥 → 固定 → 染色
→ 水洗 → 干燥 → 镜检
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涂片
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干燥 自然干燥；或者在酒精灯上方
稍微加热至干燥。 固定 过火焰2~3次。
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染色前必须固定细菌 其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上
四、实验步骤
1、菌落形态观察： 2、细菌简单染色：
3、➢细注滴菌加意少革：量兰水菌氏落染颜色。色、湿度、形状、大小、透明度 、➢染颜色色过、程边：缘是否规则等特征。
➢涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→
干燥→镜检
➢注意事项：挑取菌体
涂片
干燥
涂片：取菌量不能太大
干燥：自然干燥
固定 水洗：水流染色不能直Pa接ge 1冲2 在水洗涂菌1处2
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3、制作涂片时，菌落要符合什么要求？
革兰氏染色所用的应是不超过 24小时的培养物。
培养时间过长，阳性菌有部分 菌体老化，细胞壁不完整，染 色呈红色。
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一种菌两种颜色，难判断
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4、制作涂片时，菌落要符合什么要求？
革兰氏染色所用的应是单菌落， 不能取菌苔。如果挑取的菌落 /菌苔中多于一种细菌，结果 将难以判断。
金黄色葡萄球菌+大肠杆菌 革兰氏染色
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微生物染色法的分类
单染色法：只用一种染料染色， 也称普通染色法。用于微生物 形态的观察。
革兰氏染色法：用两种或多种 染料染色，也称鉴别染色法。 用于微生物鉴别。
金黄色葡萄球菌 结晶紫染色
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金黄色葡萄球菌+大肠杆菌 革兰氏染色
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芽孢染色法 鞭毛染色法 荚膜染色法 霉菌染色法
二是增加其对染料的亲和力
常用的有加热和化学固定两种方法
固定时尽量维持细胞原有的形
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染色 以刚好覆盖菌膜为宜；放置几
分钟。 水洗 不能直接冲洗涂面；水流要小。
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干燥 室温自然干燥或吸水纸吸干
（只能按压，不能来回擦） 镜检 低倍 → 高倍 → 油镜
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强度 较坚韧
较疏松
磷壁酸 主要成分
无
肽聚糖网 较多，交联 较少，交联度
Hale Waihona Puke 层次致密差外膜
无
有
类脂
无
有
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细胞壁的差异带来的结果是什么？
细胞壁的成分、结构的差异带来了性质差异。 乙醇短时间浸泡，能破坏革兰阴性菌的外膜和部分细胞
壁；但对革兰氏阳性菌细胞壁破坏不大。
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细胞壁的差异使不同类细菌染上不同颜色
微生物染色技术
一、染色技术
为什么微生物要染色？
目的1： 强化观察对象与背景的反差
细菌透明，染色后才易于观察。
炭疽杆菌 酚复红染色
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金黄色葡马萄拉球色菌 结耳晶道紫未染染色色
2
目的2： 微生物的鉴别、组织的形态观
察
如鉴别微生物属于革兰氏阳性还是 属于革兰氏阴性菌。
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各类型细菌 结晶紫染色
显微镜下无色 细菌被染上紫色
碘液媒染
颜色基本不变
乙醇洗脱 番红复染
有些细菌被脱色
脱色的细菌被染 上红色
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（三）染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果 24 Page 24
枯草芽孢杆菌革兰氏染色结果 25 Page 25
（四）结果记录报告
细菌 细菌形态 颜色
1#
杆状
操作练习
制作细菌涂片一个；并用显微 镜观察。
附步骤： 涂片 → 干燥 → 固定 → 结晶
紫染色1min → 水洗 → 干燥 → 镜检
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二、革兰氏染色法
革兰氏染色法是一种复染色法， 在微生物分类、鉴定、检测中 具有重要地位。
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临床鉴定细菌的步骤
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GB4789.3-2003大肠菌群检 测中，革兰氏染色是其中的必 要一步。
因此，革兰染色制片时菌量不
宜太多也不宜太少，涂片薄厚
应均匀一致。
过多
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适中
6、涂片范围为什么不能过大？
涂片范围过大，易造成颜色不一，难以判断。 原因：脱色后，难看清涂片范围，又因范围过大，复染
干燥
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曲霉的染色显微结构
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安全警示
1.加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂
2.使用燃料时避免粘到衣服上 3.放线菌和霉菌制片要减少空气流动，避免吸入孢子 4.实验完毕后洗手，金黄色葡萄球菌为条件致病菌，
二甲苯为有毒物质。
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为什么呢？？？
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革兰氏染色后细菌呈不同颜色的原因是什么？
是细胞壁的差异！ 一些细菌的细胞膜外有一层细
胞壁；有些细菌的细胞膜外有 一层细胞壁，还有一层外膜。
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
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它们的细胞壁还有什么差异？
细胞壁 革兰阳性菌 革兰阴性菌
厚度 20～80nm 10～15nm