荧光显示细胞器与细胞凋亡[资料]
大学细胞生物学考试练习题及答案321
大学细胞生物学考试练习题及答案31.[单选题]圆泡多出现在细胞有丝分裂的 （ ）A)晚期和G1期B)S期C)G2期D)贯穿整个有丝分裂期答案:A解析:2.[单选题]以下论述说法错误的是（ ）。
A)无包膜的病毒释放速率要明显快于有包膜的病毒，有包膜的病毒是以出芽的方式释放B)原核生物均是单倍体C)在光学显微镜下，原核生物的核区经过特殊染色可以呈现各种形状，但没有强的Feulgen正反应，说明它与真核细胞的核不一样D)细菌的鞭毛结构与真核细胞的鞭毛结构是完全一致的答案:D解析:原核生物鞭毛是指细胞表面着生的一至数十条长丝状、波曲的蛋白质附属物,结构简单，由基体、构型鞘和鞭毛丝3部分组成，真核生物鞭毛由鞭杆、基体和过渡区组成。
真核生物与原核生物鞭毛在运动功能上相同，均以挥鞭方式推动细胞运动，但两者在构造、运动机制等方面有显著的区别。
3.[单选题]用非特异性性微球菌核酸酶消化裸露的DNA 时，将产生（ ）：A)大约200bp的片段B)大约200bp整倍数的片段C)随机大小的片段群体D)大约146bp整倍数的片段答案:C解析:4.[单选题]下列哪种超高分辨率显微技术是由华人科学家庄小威教授创建的( )A)超分辨--受激发射损耗显微技术(STED)B)随机光学重建显微技术(STORM)C)饱和激发结构光照明显微技术(SSIM)D)荧光激活定位显微镜技术(FPALM)答案:B解析:5.[单选题]在下列蛋白中，除（ ）外，都是粘着带所需要的。
C)肌动蛋白D)中间丝答案:D解析:6.[单选题]在电镜下可见细胞核的外膜与细胞质中哪种细胞器相连？A)高尔基复合体B)滑面内质网C)线粒体D)粗面内质网答案:D解析:7.[单选题]凋亡细胞特征性的形态学改变是（ ）。
A)溶酶体膜和细胞膜破裂B)染色质边集，沿核膜分布C)线粒体嵴消失D)形成凋亡小体答案:D解析:细胞凋亡的特征性形态学改变是形成凋亡小体。
细胞凋亡过程中，细胞膜反折， 包裹断裂的染色质片断或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
细胞凋亡(APOPTOSIS)专题知识讲座
Kerr等根据绝大部分哺乳类动物细胞旳程序性 死亡过程中其超微构造变化与凋亡相同,以为全 部程序性死亡都是经过凋亡实现旳。他们这一 假设后来被广泛接受。另外某些学者以为程序 性细胞死亡是一种由细胞特定基因调控旳细胞 自杀过程, 是功能性概念, 而细胞凋亡是形态学 概念。细胞旳主动性死亡都同步符合程序性细 胞死亡和细胞凋亡旳定义, 以致许多学者把凋 亡及程序性死亡两个名词等同使用。
Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、 A1。 Bcl-2亚家族组员对细胞凋亡起克制作用
Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们旳作用与 Bcl-2亚家族旳作用相反，可增进细胞凋亡。
BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、 Bad、Bid；仅有BH3构造域。它们旳作用也与 Bcl-2亚家族旳作用相反，可增进细胞凋亡。
DNA片段化 大分子旳合成 tTG（组织转谷氨酰胺酶）旳积累并到达较高旳水平。
细胞凋亡旳形态特征
（1）凋亡旳起始；微绒毛旳消失，细胞间接触旳消失，与周围旳细 胞脱离，细胞质中，线拉体大致完整，染色质固缩，
（2） 细胞质密度增长，线粒体膜电位消失，通透性变化，释放细胞 色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，
细胞凋亡（APOPTOSIS）
一 .细胞凋亡旳研究历史
1. 凋亡概念旳形成和形态学旳研究(1972）
1972年Kerr等在英国癌症杂志刊登论文，首次提出细 胞凋亡(apotosis)旳概念。宣告了对细胞凋亡旳真正 探索旳开始。
Kerr 等在研究肝缺血时注意到两种不同旳细胞死亡形 式。第一种,细胞膜解体、细胞器形态变化、溶酶体消 失即坏死, 而第二种则细胞膜完整、细胞器形态完整、 染色质固缩、核碎裂。细胞最终自行分割为若干外膜 完整旳小体。
荧光显微镜细胞荧光成像
荧光显微镜细胞荧光成像荧光显微镜细胞荧光成像技术是一种在生物学研究中广泛应用的高分辨率成像技术。
通过将荧光探针标记在细胞或组织的特定结构上，荧光显微镜可以实时观察和记录细胞内的分子运动、细胞器结构和受体活动等细胞过程，这为科研人员提供了深入理解细胞生物学的工具。
一、原理及基本构成荧光显微镜细胞荧光成像技术的基本原理是利用化学或生物标记技术，将荧光探针与待观察的细胞或组织特定结构标记结合。
这些荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白和荧光标记抗体等。
荧光探针在特定激发波长下吸收能量，并在辐射瞬间发出特定波长的荧光。
荧光显微镜利用滤光片或激光器选择特定激发波长，以及荧光探针发出的荧光波长，通过物镜和适当的探测器，将荧光信号转化为图像。
荧光显微镜细胞荧光成像系统通常由显微镜主体、照明系统、筛选系统、激光器和探测器组成。
显微镜主体包括物镜、目镜和光源。
物镜的选择取决于所需的放大倍数和分辨率。
照明系统包括透射照明和反射照明两种方式，用于提供足够的激发光源。
筛选系统通过滤光片或光栅选择特定的激发波长和荧光波长。
激光器通常用于高光强度激发，提供更高的信噪比。
探测器可以是荧光显微镜附带的标准CCD相机，也可以是更高灵敏度的EM-CCD相机或CMOS相机。
二、应用领域荧光显微镜细胞荧光成像技术在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：1. 细胞生物学研究：荧光显微镜细胞荧光成像技术可以观察和研究细胞结构和功能，如细胞器、细胞骨架、受体分布和细胞凋亡等。
2. 分子生物学研究：通过标记特定的分子，荧光显微镜可以追踪分子在细胞内的分布和运动，如蛋白质、核酸和细胞信号分子等。
3. 疾病诊断与研究：荧光显微镜细胞荧光成像技术可以用于疾病诊断，如癌症细胞的检测和定位，以及疾病的发病机制研究。
4. 药物研发：荧光显微镜技术可以用于药物筛选和药效评价，观察药物对细胞的影响和效果。
三、发展趋势随着荧光显微镜细胞荧光成像技术的不断发展，其应用范围和分辨率都得到了显著提高。
细胞凋亡
流式细胞仪细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
PI-Annexin V双标法原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外侧；磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS具有高度的结合力；将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细结果判断•正常活细胞AnnexinV 、PI均低染；•凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；•坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
细胞凋亡(apoptosis)：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（又称为程序性细胞死亡）细胞凋亡与坏死的比较细胞凋亡的生理病理意义①确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞；②维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞；③发挥积极的防御功能：病毒感染细胞凋亡，阻止病毒复制细胞凋亡的过程大致过程：凋亡信号转导；凋亡基因激活；细胞凋亡的执行；凋亡细胞的清除凋亡的四个阶段：细胞凋亡的形态学改变细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体，被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。
不引起炎症反应和次级损伤。
细胞凋亡的生化改变1. DNA片段化：形成180-200bp或整数倍的片段，在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状”条带，是判断凋亡发生的客观指标之一。
凋亡后DNA Ladder的agarose 电泳检测3. Caspase的激活及其作用Caspase（含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶）：一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶，又称死亡蛋白酶。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验
流式细胞仪检测细胞凋亡实验PI单染色法实验原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
实验材料细胞试剂/试剂盒PBS PI 蒸馏水乙醇仪器/耗材棕色瓶 400目筛网流式细胞仪实验步骤一、收集细胞收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500~ 1 000 r/min 离心5 min，弃去培养液。
二、细胞洗涤3 ml PBS洗涤1次。
三、乙醇固定离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。
细胞凋亡.
③、核有丝分裂相关蛋白，如NUMA、D4G等； ④、DNA断裂因子(DFF)复合物中的45kDa多肽 总之，caspase家族是细胞凋亡过程中 必不可少的，并最终导致凋亡细胞的形态和一 系列生物化学改变。
3、P53
七、在肝病中的细胞凋亡
• 酒精性肝病ห้องสมุดไป่ตู้
• 病毒性肝炎 • 胆汁淤滞性肝病
酒精性肝病（alcoholic
1.Bcl-2
家族
Bcl-2家族包含一组相关蛋白，它们分别与Bcl-2在4 个保守区具有同源结构域(BH1-4)，并以此作为结构基 础，形成同源性或异源性二聚体，通过蛋白—蛋白之 间的相互作用，调节细胞的凋亡，在细胞凋亡途径的 上游远端，构成一个重要的细胞内凋亡调控点。
Bcl-2家族的组成
• 抑制凋亡因子 Bcl-2、 Bcl-xL、Bcl-w、McL-l和Al • 促进凋亡分子 Bax、Bcl-x、Bak、Bad、Bik、Bid、Hrk、 Bin等
讲演到此结束，感谢大家的支持！
特别感谢李冬智同学提供的资料！
2002诺贝尔奖得主
英国的西德尼· 布伦纳(Sydney Brenner)
约翰· E· 苏尔斯顿 (John E.Sulston)
•
美国的H· 罗伯特· 霍维兹 (H.Robert Horvitz)
二、凋亡概念：
细胞凋亡是细胞循 自身程序结束其生命 的主动死亡的过程， 具有特征的形态和生 化改变，是由基因控 制的个别细胞发生的 自主有序的死亡。即 是由基因控制细胞有 目的，有选择性的自 我消亡过程，这种淘 汰机制是保证生命进 化的基础。
2002年诺贝尔生理学或医学奖
•
瑞典卡罗林斯卡医学院于10月7日正式宣布把2002年 诺贝尔生理学或医学奖，授予来自英国和美国的三位 科学家，以表彰他们发现在器官发育和细胞死亡过程 中的基因规则。
流式测细胞凋亡原理
流式测细胞凋亡原理
细胞凋亡是一种形态学特征独特的程序性细胞死亡方式，它在多种生理和病理状态下发挥重要作用。
流式细胞术可以用来分析和测量细胞凋亡，其中包括细胞表面标记物的检测和细胞染色。
流式细胞术是一种流式细胞仪结合荧光标记物的技术。
在细胞凋亡的研究中，最常用的荧光染料是亚碧菜素（annexin V）和PI（propidium iodide）。
亚碧菜素可以结合凋亡细胞表面的磷脂（phosphatidylserine），而PI则可以进入破损的细胞膜并结合DNA。
流式细胞术中，细胞样本首先经过适当的处理，如细胞固定和染色，以保持细胞形态并增强荧光信号。
然后，样本通过流式细胞仪中的流动通道，单个细胞经过激光束的照射而产生荧光信号。
流式细胞仪会同时检测和记录细胞的形态学特征和荧光信号。
在细胞凋亡的测量中，亚碧菜素和PI的荧光信号用于区分不同类型的细胞。
在正常细胞中，磷脂位于细胞膜的内侧，不会结合亚碧菜素。
而在凋亡细胞中，磷脂外露到细胞膜的外侧，可以与亚碧菜素结合。
通过检测亚碧菜素的荧光信号，可以确定凋亡细胞的比例。
同时，PI的荧光信号用于鉴定破损的细胞，因为PI只能进入破损的细胞并结合DNA。
通过流式细胞术，可以获得细胞凋亡的定量信息，例如凋亡细
胞的比例和凋亡细胞的亚型。
这对于研究细胞凋亡的机制以及相关疾病的发生和发展具有重要意义。
细胞生物学技术-细胞凋亡
例：强烈应激反应 糖皮质激素
淋巴细胞凋亡
病原体：细菌、病毒等。例：HIV
（2）抑制因素（抑制细胞凋亡）
CD4+T细胞凋亡
细胞生长因子：如IL-2 、神经生长因子
激素 例：ACTH
肾上腺皮质细胞凋亡
其他：如Zn2+、药物、某些病毒等
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细胞凋亡信号的转导
凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序
➢ （3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小 不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细 胞膜所包围；
➢ （4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
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细胞凋亡DNA的片段化
8
细胞凋亡的过程及机理
➢ 接受凋亡信号
➢ 凋亡调控分子间的相互作用
➢ 蛋白水解酶（caspases）的活化
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细胞内氧化还原状态改变的检测
• 当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧 化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从 而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移 到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
• 由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除 了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风 等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没 有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。
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线粒体膜势能（DYmt）的检测
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Caspase家族的结构与分类
ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE（白介素1转换酶） 是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与 凋亡，但不起主要作用： Caspase-1，Caspase-4， Caspase-5， Caspase-11，Caspase-12，Caspase13， Caspase-14。
细胞凋亡检测方法总结
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。
Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。
PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。
所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。
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细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。
2.线粒体的荧光标记 P70
罗丹明123－－特异性的线粒体荧光染料, 是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具 有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸 引染料并将它保持在线粒体中,经蓝光激发,呈现 黄绿色荧光.可作为线粒体膜电位的灵敏指示.
罗丹明123结构式
电子传递和氧化磷酸化的偶联
实验方法:
P71
1.取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(+)冲洗3次，每 次漂洗浸泡2--3分钟，
2. 加入罗丹明123标记液， 37℃培养箱孵育15分钟， 3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次3--5分钟， 4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞 的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观 察。
3--5分钟
2. 滴加DIO-C6(3)荧光染液，室温染色1分钟， 3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次5分钟， 4.临时封片：滴1－2滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的 盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。
4.细胞凋亡
细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡 （Programmed cell death简称PCD），是由基因编程 控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节 机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。 细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机 体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体 数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面， 而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均 具有十分重要的作用。
Emission （发射频谱，nm）
Cy2TM GFP(Red Shifted) YO-PROTM-1 YOYOTM-1 Calcein FITC FluorXTM AlexaTM488 Rhodamine ABI,5-FAM Oregon Green TM 500 Oregon GreenTM 488 RlboGreenTM Rhodamine GreenTM Rhodamine123 Magnesium GreenTM Calcium GreenTM TO-PROTM-1 TOTO®-1 ABI,JOE
常用荧光染料的激发及发射波长
Fluorescent Dye Excitation （激发频谱，nm）
489 506 488 507 491 509 491 509 494 517 494 518 494 519 490 520 110 496 520 494 522 503 522 496 524 500 525 502 527 507 529 506 531 506 533 514 533 514 533 520 548
530 550 549 565 542 568 558 568 564 570 550 570 547 572 550 575 565 575 550 575 549 576 555 580 555 580 570 590 581 596 588 608 590 615
Fluorescent Dye
Excitation （激发频谱，nm）
Emission （发射频谱，nm）
Texas Red® 595 615 Nile Red 549 628 YO-PROTM-3 612 631 YOYOTM-3 612 631 R-Phycocyanin 618 642 C-Phycocyanin 620 648 TO-PROTM-3 642 660 TOTO®-3 642 660 DiD DilC'(5) 644 665 Cy5TM 649 670 Thiadicarbocyanine 651 671 Cy5.5 675 694
Fluorescent Dye
Excitation （激发频谱，nm） Emission （发射频谱，nm）
BODIPY®530/550 Dil BODIPY®TMR BODIPY®558/568 BODIPY®564/570 Cy3TM TRITC Magnesium OrangeTM Phycoerythrin,R & B Rhodamine Phalloidin Calcium OrangeTM Pyronin Y Rhodamine B Rhodamine RedTM Cy3.5TM ABI,ROX Calcium CrimsonTM
1. 细胞核的荧光显示 P60-62
吖啶橙（Acridine Orange)
吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA双链间与双链DNA结合，经 蓝光激发后发出亮绿色荧光， 又可以静电堆积的方式与单链DNA或RNA 的磷酸根结合，蓝光激 发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示DNA,RNA。
异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）
细胞器的荧光标记
熟悉荧光标记各种细胞器的常用方法及原 理 掌握荧光显微镜下各种细胞器的形态及 分布
细胞膜
核被膜
线粒体
膜相结构 细 胞 结 构
内质网 高尔基体 溶酶体 过氧化物酶体 染色质，染色体，核仁，核糖体
非膜相结构 核骨架，核纤层
细胞骨架
微管 微丝
中间纤维
4人一组
1. 2. 3. 4. 细胞核的荧光显示 P60-62 线粒体的荧光标记 P70 内质网的荧光标记 P64-67 细胞凋亡的形态学观察
实验方法: P62
1.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于 一次性小培养皿内，加入95％乙醇固定15－30分钟，取 出自然干燥； 2.加入1％醋酸酸化30秒；
3.在盖玻片标本上滴加0.01％吖啶橙染液，染色5－10 分钟；
4.去染液，用磷酸缓冲液冲洗1分钟； 5.用1/10氯化钙分化30秒－3分钟； 6.用PBS漂洗玻片3次，每次数秒； 7.临时封片：滴1－2滴PBS于载玻片上，将含细胞的盖 玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。
细胞核附近发绿 色荧光的圆形或 短杆状颗粒即为 线粒体
3.内质网的荧光标记
1.材料 培养储存液：0.5mg/mL DIO-C6(3)存储液， 4℃避光，
标记液：2.5ug/mL DIO-C6(3)， 4℃避光。 0.5%戊二醛
实验方法:
P67
1.取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液 固定细胞10分钟， 2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗时浸泡