用Image-Pro Plus分析免疫组化(IHC)染色强度的方法
使用imagepro-plus测量荧光强度
使用imagepro-plus测量荧光强度如今，使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍，荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋白的表达强度，自然而然的，大家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切片的荧光照片来分析其荧光强度，并以此来表示相应蛋白的表达强度。
非常令人沮丧的是，这个想法是很难实现的。
这个网页详细说明了理由。
/answers/showquestion.asp?faq=36&fldAuto=325里面的结论是：You DON'T! Image Pro Plus can provide Intensity or Density measurements for any image. However, unless the image acquisitions system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world.IPP的分析结果与实际情况是有很大误差的，这个误差不是IPP的错，而是在制作样品及拍摄照片的过程中引入的。
所以在介绍使用IPP分析荧光照片的方法之前，首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。
这可能比IPP 的操作还要重要。
荧光显微镜拍摄的样品，是使用荧光染料染色的，使用荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光片与荧光滤光片。
正确选用滤光片能得到足够强的荧光，但一般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光片，更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵，只能求其次，使用波段相近的滤光片，荧光强度稍低一些。
粗略的选择是：红色荧光染料，使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。
绿色荧光染料，使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。
蓝色荧光染料，使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。
更精细的滤光片选择，可以参照下表：/jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls在拍摄荧光照片时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照片一样，要确保每张照片的拍摄条件完全一致。
用ImagePro_Plus_分析免疫组化图片共39页
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
IPP 分析免疫组化图片
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15
哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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16
使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
照片B
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比较体积！
IODdensi(txy, y)ds
S
densi(tmy ea)nIOD/area
光 密 度
尺寸
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1.4 实际图片的情况很复杂的。
阳性样品染色深，阴性样品染色浅。
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直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density
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3.2.1开始使用IPP
IPP的程序界面是典型的windows风格。它包 含了最常用的一些windows程序的一些通用工 具。
不能使用自动白平衡校正，但在拍摄前使用手动的白 平衡校正背景色彩却是必须的。在拍摄照片时要对相 机进行背景色彩校正，使得拍摄出的照片中空白的背 景呈白色。这种较正将应用于所有拍摄的照片上，与 自动白平衡较正不同。自动白平衡较正是对每一张照 片都进行各自不同的色彩较正。
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应当把照片存为无损压缩格式TIFF
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6
处理照片时用的却是灰度
各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为 了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值 来表示。
ImageJ实用技巧之免疫组化与特殊染色
ImageJ实⽤技巧之免疫组化与特殊染⾊众所周知，对于科研狗来说，实验并不是拍出那么⼏张靓丽图⽚就能万事⼤吉，不拿出对应的统计图来说明问题，定会被⽼板骂的体⽆完肤。
今天为⼤家带来⼩弟平时分析数据⽤的最多最常⽤，堪称神器的软件ImageJ。
这是⼀张肝脏的天狼猩红染⾊图，其中红⾊代表的是I与III型胶原阳性染⾊，统计这张图中红⾊部分占整张图⽚的⾯积百分⽐。
1.在电脑上打开这个神器ImageJ，会出现如图显⽰的⼯具栏2. 将需要统计的图⽚在imageJ中打开3.在图3显⽰的⼯具栏中选择image按钮，然后选择Type，再选择RGBStack按钮。
4.此时再将图⽚下⽅的调节滑轮拉到中间或是最右边，以获得最佳的对⽐度。
5.再选择image按钮，然后点击Adjust，再Threshold按钮6.出现threshold窗⼝7.此时只需调节上下两个滑轮即可对图⽚阳性染⾊⾯积进⾏标记（⼀般免疫组化或特殊染⾊只需调节下⾯这个滑轮，免疫荧光则相反）8.此时的红⾊部分就是你的阳性染⾊部分，然后进⼊统计阶段，先点击Analyze按钮，然后Set Measurements按钮，出现弹窗后再点击Area fraction按钮（⼀般这⼀步第⼀次设置后，以后都不⽤设置了）9.计算出阳性染⾊⾯积的百分⽐，点击Analyze按钮，然后点measure按钮即可，图中6.164即为阳性染⾊⾯积百分⽐.....华丽丽的分隔线.....这是⼀张免疫荧光图，我需要统计其中红⾊部分的阳性染⾊⾯积说完了免疫组化与特殊染⾊的部分，其实免疫荧光的统计和上⾯⼀样，只是在threshold这⼀步有点差别1．1---6步骤都是⼀样，按照处理变成了下图2.按图下⽅的滑轮保持在左边不变，然后在threshold窗⼝将下⽅滑轮滑到最右边，上⽅滑轮左右调节3.计算出阳性染⾊⾯积的百分⽐，点击Analyze按钮，然后点measure按钮即可总结：今天主要是给⼤家演⽰了imageJ最常⽤的两个功能，不过这种统计也有局限性，如果碰见Ki67这种需要计算增殖细胞个数的免疫组化，则推荐⼤家⽤IPP进⾏统计。
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
mxh8174
2006-07-12 10:22
非常感谢，我已从网上下载下来了一个图像分析软件可是自己研究了好一阵还是一 头雾水，谢谢无私的奉献，使我有为实验节省了一点经费。祝工作顺利！
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锦上添花：SCI论文修改润饰
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2006-04-21 07:54 陈老师，可否给我发一个中文说明书呢？英文水平太差了！感谢哦！ andybalake@
• 国际著名遗传学家谈家桢院士迎来百岁华诞
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2006-04-22 17:23
jss2004
• 【交流】甘露醇的临床应用误区及经验
2006-09-22 15:59 受益非浅，谢谢
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发贴: 64 积分: 3 得票: 5 状态: 离线
• "星光灿烂"的大地
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/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=2&ppg=2&age=0（第 7／12 页）2008-9-20 7:55:05
SCI医学论文翻译
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/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=2&ppg=2&age=0（第 2／12 页）2008-9-20 7:55:05
手把手教你使用Imagepro-Plus(1.入门)(修订0700905) - Welcome to Forum
医学文献看不懂怎么办？
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2005-12-30 11:03
IPP-分析免疫组化图片 ppt课件
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2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪
其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。
可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域 其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染
料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。
PPT课件
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2.2 抽样测量光密度
在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。
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哪一个染色物更多？
染色区域颜色深度接近，染色面积有差异。
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使用不同的area会得到不同的结论 要结合切片情况来判断。
IOD对整张图片的面积作平均。 IOD对特定组织区域的面积作平均。 IOD对显色的组织区域作平均。
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对整张图片区域进行平均的情况比 较少，这张图片中黄色的IOD值主 要来自于中间一块区域内。
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1.3比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大
照片A
照片B
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比较两张照片的染色物质量的差别
两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大
照片A
照片B
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这回该怎么看？
A的颜色深，面积小。 B的颜色浅，面积大。
照片A
照片B
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1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density ) 与Mean Density
将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。
IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到 Mean density，此值反映了目标物质的单位面 积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时， 就是比较它们之间的平均光密度值的大小。
20150611_Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能_刘儒瑜
Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能
免疫组化图片分析
免疫组化的基本原理：
区域越黑光密度越大，蛋白表达越强。
一般可以由灰度值转换为光密度值计算，用平均光密度值计算（一块区域的光密度总和/区域面积）。
操作步骤：
1、光密度校正
将灰度值转为光密度
2、设置测量参数
参数包括面积、IOD等
设置标记的操作，填充，平滑，是否包括边缘的保存测量环境文件等
3、选择测量区域
图形选中测量区域
3、设置色彩选择
4、
选择区域的HIS设置，
保存选色文件
5、测量区域面积，在测量积分光密度
6、批量操作等
一组免疫组化图片包括几组样本，而每个样本需要测量多次去平均，因此需要保存操作标准，以进行批量操作。
备注：拍摄条件要一致，相同显微镜条件，同一放大倍数，手动相机
基本功能
校正显微镜图片背景不均匀
操作步骤：
获得空白的背景图片
打开样本图片
单击背景校正功能选项
分色选择工具
HIS和rgb调整图像颜色
调整图片亮度
包括调整亮度和对比度
调整图片伽马
滤镜Filter
对灰度和二值图像处理效果较好
图象增强，平滑，去噪，边缘处理，形态学处理等
数据收集
包括对目标的计数，目标参数例如面积，长宽等计算。
IPP 分析免疫组化图片课件
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34
控制相机曝光时间
• 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈 现纯亮的白色。
• 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度 值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一 下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很 容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的 偏差。同时背景灰度值也不宜过高。
• 准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域的 灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度值。
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7
用标准样品才能把OD值与样品量关联到一起
• OD值是一个没有单位的相对值。
• 使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对 电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。
• 电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数 函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准 点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标 准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分 析。
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3.用IPP分析免疫组化图片的过程
• 拍摄样品照片。 • 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of
interesting）。 • 测量该区域的IOD。 • 选择并测量有效统计区域的面积 • 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） • 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 • 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间
随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？
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2.3 ImagePro plus的独特优势。
• 准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密度参数。
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节的
禁
忌
制
作
用Image-Pro Plus分析免疫组化（IHC）染色强度的方法以这两张图为例：
眼睛没毛病的都一眼可以看出左边是阴性，右边是阳性，但是就是有
些傻X审稿人非要你去把组化的结果做个量化分析
好吧，量化就量化吧，但是怎么量化呢？
首先，把这两张图合成一张，用PPT啊，PS啊都可以，如下：
鬼
鬼节
的
禁
忌
制
作然后，用Image-Pro Plus打开这张图，点这个图标：
count and measure objects
出来这个框：
选Manual，然后点Select Colors，出来这样一个框：
点这个图标：
节的
禁
忌
制
作
然后在图上点选棕色的区域，图就变成大概这个鬼样子了：
然后点这个键：
然后close：
然后图片就变成这样了：
鬼
鬼节
的
禁
忌
制
作然后用PS或者其他什么软件把这一张图片平均分成两张：
然后用Image-Pro Plus 打开这两张图中的其中一张，打开后点这个
节的
禁
忌
制
作
图标：
count and measure objects
出来这个框：
选
然后点
然后图片变成这个鬼样子：
鬼
鬼节
的
禁
忌
制
作然后点这个
就会出来这个：
看这个数值
然后看这个图片的分辨率：473×360=170280（自己百度怎么看）
那么这个IHC的染色强度就是49320/170280=28.96%
另一幅图片也用同样的处理方法，得出的数据就可以用来做统计分析
节的
禁
忌
制
作
然后作图了。
为什么要先把两张图合并然后又分开呢？这个问题自己去想吧。
That‘s all. Thank you!
鬼。