蛋白质的表达和纯化技术
蛋白质的表达和纯化技术
概述
蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们扮演着各种不
同的角色，如催化酶、参与信号转导等。了解蛋白质的结构和功能，能够帮助科学家研究生命过程和疾病发生的机制。因此，蛋
白质表达和纯化技术是现代生物学研究中的重要环节。
蛋白质表达技术
蛋白质表达技术是指将目标蛋白质基因导入到宿主细胞中，使
其能够在细胞内大量表达目标蛋白质的过程。根据目标蛋白质的
性质和功能需求，可以选择不同的表达系统，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌是最常用的表达系统之一。其具有成本低、表达量高
等优点，同时易于培养和操作。但是，大肠杆菌的表达系统在表
达复杂蛋白质时存在很多问题，如蛋白毒性、折叠错误等。因此，针对不同类型的目标蛋白质，需要选择不同的表达系统，并优化
其表达条件。
蛋白质纯化技术
蛋白质纯化技术是指从混合物中纯化目标蛋白质的过程，包括
初级纯化、中级纯化和高级纯化等步骤。初级纯化包括离心、过
滤和电泳等方法，主要是为了去除大分子和杂质。中级纯化主要
使用柱层析和凝胶电泳等技术，分离目标蛋白质和杂质。最后，
高级纯化主要通过高效液相色谱（HPLC）等手段，获得高纯度的
目标蛋白质。
在进行蛋白质纯化时，需要考虑目标蛋白质的性质，如分子量、电荷性、亲和力等。根据这些属性，可以选择合适的纯化方法，
并进行优化。同时，需要注意纯化过程的选择和条件设置，以确
保目标蛋白质的活性和稳定性。
结论
蛋白质表达和纯化技术对于生物学研究和生物制药等领域具有
重要的意义。在不同的研究领域中，选择合适的表达和纯化技术
是确保研究成功的关键之一。因此，对蛋白质表达和纯化技术的
理解和掌握，有助于推动生物科技的发展。
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤： 一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
蛋白质的表达和纯化技术
蛋白质的表达和纯化技术 概述 蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们扮演着各种不 同的角色，如催化酶、参与信号转导等。了解蛋白质的结构和功能，能够帮助科学家研究生命过程和疾病发生的机制。因此，蛋 白质表达和纯化技术是现代生物学研究中的重要环节。 蛋白质表达技术 蛋白质表达技术是指将目标蛋白质基因导入到宿主细胞中，使 其能够在细胞内大量表达目标蛋白质的过程。根据目标蛋白质的 性质和功能需求，可以选择不同的表达系统，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌是最常用的表达系统之一。其具有成本低、表达量高 等优点，同时易于培养和操作。但是，大肠杆菌的表达系统在表 达复杂蛋白质时存在很多问题，如蛋白毒性、折叠错误等。因此，针对不同类型的目标蛋白质，需要选择不同的表达系统，并优化 其表达条件。
蛋白质纯化技术 蛋白质纯化技术是指从混合物中纯化目标蛋白质的过程，包括 初级纯化、中级纯化和高级纯化等步骤。初级纯化包括离心、过 滤和电泳等方法，主要是为了去除大分子和杂质。中级纯化主要 使用柱层析和凝胶电泳等技术，分离目标蛋白质和杂质。最后， 高级纯化主要通过高效液相色谱（HPLC）等手段，获得高纯度的 目标蛋白质。 在进行蛋白质纯化时，需要考虑目标蛋白质的性质，如分子量、电荷性、亲和力等。根据这些属性，可以选择合适的纯化方法， 并进行优化。同时，需要注意纯化过程的选择和条件设置，以确 保目标蛋白质的活性和稳定性。 结论 蛋白质表达和纯化技术对于生物学研究和生物制药等领域具有 重要的意义。在不同的研究领域中，选择合适的表达和纯化技术 是确保研究成功的关键之一。因此，对蛋白质表达和纯化技术的 理解和掌握，有助于推动生物科技的发展。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理 蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。 1. 盐析法 盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。 2. 凝胶过滤法 凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。 3. 离子交换色谱法 离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的
方法。离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。 4. 亲和色谱法 亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。 5. 逆渗透法 逆渗透法是利用溶剂通过半透膜分离蛋白质和其他溶质的一种方法。逆渗透法基于溶剂分子比溶质分子更容易通过半透膜的原理。在逆渗透法中，蛋白质溶液加入到逆渗透膜中，在施加压力的作用下，溶剂通过膜而不是溶质，从而将蛋白质从其他成分中分离出来。不同大小的可逆渗透膜可以用于选择特定的蛋白质。 6. 层析法 层析法是一种广泛应用于蛋白质纯化的方法，其原理基于蛋白质与固定相之间
蛋白质纯化方法
蛋白质纯化方法 蛋白质作为生物体内重要的功能分子之一，其纯化方法的选择对于生物学研究和工业生产中的蛋白质制备具有至关重要的意义。纯化蛋白质能够去除与目标蛋白质无关的其他生物分子，从而提高蛋白质的纯度和活性。在本文中，将介绍几种常用的蛋白质纯化方法。 一、溶液层析 溶液层析是一种常用的蛋白质纯化方法。该方法利用分子大小、电荷和亲水性等差异，将混合物中的蛋白质分离开来。常见的溶液层析方法包括凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。 1. 凝胶层析 凝胶层析是一种基于分子大小的分离方法。常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺薄膜和聚糖凝胶等。这些凝胶材料具有不同的孔隙结构，通过选择合适孔径的凝胶材料，可以将目标蛋白质与其他分子分离开来。 2. 离子交换层析 离子交换层析是一种基于分子电荷的分离方法。该方法利用纯化材料表面的离子交换基团与蛋白质间的电荷交互作用，将蛋白质分离开来。阳离子交换材料选择带有阴电荷的材料，而阴离子交换材料选择带有阳电荷的材料。 3. 亲和层析
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。该方法利用纯化材料表面的特定化合物与目标蛋白质之间的特异性相互作用，将目标蛋白质与其他分子分离开来。常见的亲和层析材料有亲和树脂和亲和薄膜等。 二、电泳分离 电泳分离是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。常见的电泳分离方法包括SDS-PAGE和等电聚焦。 1. SDS-PAGE SDS-PAGE是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。该方法利用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质分子包裹成带负电的复合物，使其在凝胶电泳时按照分子大小分离开来。通过引入分子量标记物，可以根据标记物的迁移距离来确定目标蛋白质的分子量。 2. 等电聚焦 等电聚焦是一种基于蛋白质电荷的分离方法。该方法利用胶体颗粒的电动流动使蛋白质在电泳过程中在不同的pH值时停止运动，从而达到分离的目的。等电聚焦在凝胶上形成pH梯度，蛋白质在梯度中由于电荷变化发生位置变化。 三、高效液相色谱 高效液相色谱（HPLC）是一种高效的蛋白质纯化方法。该方法通过利用溶液中蛋白质与色谱填料之间的相互作用，实现目标蛋白质与其他分子的分离。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的 1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况 2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质 3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白 4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质 实验原理 1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。 2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。 3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。 4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。在E. coli的pET表达系统中表达N端含有His-tag （组氨酸六聚体）的融合靶蛋白，然后用亲和层析的方法进行纯化。 多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的6 X His-tag 的蛋白质能结合于固化Ni2+树脂，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。当我们用高浓度的咪唑（imidazole）溶液洗脱的时侯，咪唑便与融合蛋白his-tag 的咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白洗脱下来。 5.蛋白质杂交法：蛋白质杂交也称Western blotting，首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，本实验使用电泳印迹湿转法。这种方法是用有孔的塑料和泡沫将凝胶和NC/PVDF膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极
蛋白质的表达纯化及结晶
2.3.2.2 蛋白质表达、纯化 （1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。 （2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。 （3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。 （4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。 （5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。 （6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。收集各个出峰位置（根据280nm的吸光值）附近的收集管。进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白质出峰位置、纯度和浓度。 （8）超滤浓缩：将含有目的蛋白的洗脱液用超滤杯浓缩到2 ml。 （9）分子筛柱层析纯化：注射上样到已经用溶液C（10 mM Tris-HCl，pH8.0，100 mM NaCl）平衡好的凝胶过滤层析柱Superdex 200上。用溶液C进行洗脱。出锋位置与蛋白的大小以及形状相关。收集蛋白峰进行SDS-PAGE电泳，检测蛋
生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和 功能作用。在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验 材料。蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。 一、蛋白质表达技术 蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。原核细胞 表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物 细胞，其主要的表达技术有以下几种： （一）重组蛋白质大规模表达 重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工 程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。大肠杆菌 是目前最常用的宿主。一般来说，要将目的基因插入到选择性表 达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结
合。表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。 （二）GST融合蛋白表达 GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。 （三）His标签蛋白表达 His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。 二、蛋白质纯化技术
蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质， 获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。 （一）离子交换层析法 离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相 应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。离子交换层 析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。 （二）凝胶过滤层析法 凝胶过滤层析法是利用分子量差异而进行分离的一种纯化方法。凝胶过滤层析操作简单，包容性较强，可有效消除杂质，因此常 被用于初步纯化和柱前处理。 （三）亲和层析法 亲和层析法是通过靶标蛋白本身与某种化合物反应，形成化学 亲和作用进行分离纯化。亲和层析法成本高，但可以快速、高效、
蛋白质的高效表达和纯化技术
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构， 也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。因此，蛋白质的 高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。 蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。原核表达系 统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的 蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过 转化酵母细胞实现表达。大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基 因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行 表达。相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达 速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化 和折叠过程。 真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达 和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺 乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常 会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。而载体的 选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表 达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对 于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和 pEF系列载体。 在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋 白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或 离子浓度来调节分离效果。亲和层析则是通过利用蛋白质与其特 异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离 子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现 分离。而凝胶过滤则是将混合的蛋白质分子在凝胶中进行分子量 筛选。这些方法可以组合使用，构建复合层析方法，来进行高效 的纯化。 此外，现代生物技术还发展了很多新的高效表达和纯化技术， 例如标记蛋白技术、热稳定蛋白技术、分子筛技术等。在标记蛋
蛋白质表达和纯化技术的研究进展
蛋白质表达和纯化技术的研究进展 随着现代科技的发展，人们对于生物分子的研究越来越深入。而蛋白质作为生 命体中重要的分子，它的表达和纯化技术对于不同的生物学研究领域具有重要意义。在过去的几十年中，人们在蛋白质表达和纯化技术方面进行了大量的研究和实践，取得了很多进展和突破，但同时也暴露出了一些局限和挑战，为此本文将会就蛋白质表达和纯化技术的研究进展进行论述。 一、蛋白质表达技术的发展 蛋白质的表达是指将蛋白质基因转录成mRNA，再由mRNA翻译为蛋白质的 过程，是进行蛋白质研究的基础。在蛋白质表达技术的发展过程中，人们主要采用细胞工程和基因工程的手段。目前最为流行的表达系统包括细胞外表达，细胞内表达和包涵体表达等。 1.细胞外表达 细胞外表达是指将蛋白质表达于细胞外液中，利用细胞分泌系统实现。利用大 肠杆菌表达系统进行细胞外表达是目前最为流行的方法。该方法表达效率高，并能够表达出大量纯净的蛋白质。 2.细胞内表达 细胞内表达是指将蛋白质表达于细胞质中。利用大肠杆菌表达系统进行细胞内 表达，同样是比较常用的方式。细胞内表达更加便于进行后续的纯化，但是容易受到细胞毒性和不可溶性蛋白质的影响。 3.包涵体表达 包涵体表达是指将蛋白质表达于大肠杆菌的包涵体内。由于其表达效率高，常 被用于表达大量纯净的蛋白质。但是在后续的纯化过程中，容易遇到很多问题，包括包涵体的重折叠，难以溶解等。
二、蛋白质纯化技术的发展 蛋白质纯化是指将蛋白质从复杂的混合物中提取出来并纯化的过程。蛋白质纯 化技术对于后续的结构和功能分析有着重要的意义。在蛋白质纯化技术的研究和实践中，人们采用了许多方法和策略，包括亲和纯化、聚焦电泳、凝胶过滤、逆流层析等，下面将会对其中几种方法进行论述。 1.亲和纯化 亲和纯化是指利用蛋白质与其他化合物之间的特定亲和性进行纯化的方法，曾 经被认为是一种高效且特异性很高的分离技术。但是由于该方法需要特别定制的亲和柱，成本较高，同时含杂质蛋白质的影响因素和难以准确预测相互作用是亲和纯化存在的挑战。 2.聚焦电泳 聚焦电泳是一种基于电泳法分离蛋白质的技术，可根据蛋白质的等电点进行分离。这种方法的优势在于它能快速准确地鉴定多个蛋白质分离谱图，但主要缺点是它对千分之一甚至百万分之一的成分分离效果不佳。 3.凝胶过滤 凝胶过滤是指利用不同孔径大小的过滤膜，将蛋白质按照分子大小进行分离。 该方法操作简单，同时通过凝胶过滤法可以分离多个蛋白质组分，但该方法对于亲水和疏水分子的分离效率有差异，卡特容积过大等问题也会给实践带来很大的挑战。 4.逆流层析 逆流层析是指利用某种基质和操作条件，在逆向流的作用下，将目标蛋白质从 混合物中分离出来的方法。该方法存在化学亲缘性好、配体可复性强、鉴别性好等优点，但需要精细的操作和配对参数。 三、结论
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化 重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。 一、重组蛋白质表达过程 1. 选择表达宿主 重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。 2.构建表达载体 表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。常用的表达载体有质粒、病毒载体等。质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。 3.转染和表达 将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。 4.优化表达条件
为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。常 见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。 二、重组蛋白质的纯化过程 1.细胞破碎与分离 表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需 要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。细胞破碎方法包括机械法、 超声法、高压法等。分离方法包括离心、电泳、柱层析等。 2.柱层析 柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸 附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。常用的柱层析方法有离子交换 层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。 3.其他纯化方法 除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质， 以获得纯度更高的重组蛋白质。 三、重组蛋白质应用与挑战 重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。 2、设计蛋白表达引物.引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3）、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。6左右,加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%—60％，使用时自己计算用量. 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm)， 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1。如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2。 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌. 1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD〉=1.5,约5h左右，视菌种
蛋白质表达与纯化技术进展
蛋白质表达与纯化技术进展 蛋白质表达和纯化技术是现代生命科学领域的重要研究方向之一。蛋白质是生物体的重要组成部分，它们在细胞内发挥多种重 要的功能，如催化代谢反应、维持细胞结构和信号传递等。因此，研究蛋白质的结构和功能对于深入理解生命现象和开发新药物具 有重要意义。 在过去的几十年中，蛋白质表达和纯化技术得到了迅猛发展。 这些技术的主要目的是在大量表达和纯化蛋白质的同时保持其结 构和功能的完整性。下面将介绍一些主要的蛋白质表达和纯化技 术进展。 一、蛋白质表达技术 1. 原核表达系统 原核表达系统是最早被开发出来的蛋白质表达系统之一。该系 统利用了细菌的表达机制来表达目的蛋白质。原核表达系统主要 包括大肠杆菌表达系统和蓝藻表达系统。这两个系统具有表达效
率高、操作简便等优点。同时，这些系统也存在着一些问题，如 无法表达复杂的蛋白质、蛋白质折叠和结构的失真等。 2. 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母表达系统是一种简单易用的真核表达系统，被广泛应 用于蛋白质的高效表达。与其他真核表达系统相比，酿酒酵母表 达系统具有表达效率高、生长速度快等优点。由于酿酒酵母表达 系统是一种酵母菌，因此其表达的蛋白质具有真核生物的折叠和 修饰机制，表达的蛋白质可以更好的保持其原始性和功能性。 3. 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是一种常见的真核表达系统，它利用了昆虫 细胞的表达机制来表达目的蛋白质。与其他真核表达系统相比， 昆虫细胞表达系统具有表达效率高、蛋白质修饰机制完整等优点。由于昆虫细胞表达的蛋白质具有真核生物的修饰机制，因此该系 统被广泛应用于研究真核生物的蛋白质结构和功能。 二、蛋白质纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁 殖和免疫功能起着至关重要的作用。而重组蛋白质则是利用基因 工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通 过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。这种技术不仅可以 生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病 的治疗和新药的研发有着重要的意义。 一、蛋白质表达技术 蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。选择适当的宿 主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。常用的宿主细胞包 括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。 1.大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于 重组蛋白质的表达和纯化。其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。 3.哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。 二、蛋白质纯化技术 蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。 1.亲和层析法
亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。 2.离子交换层析法 离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。 3.凝胶过滤层析法 凝胶过滤层析法是利用孔径大小的差异进行蛋白质分离的一种方法。柱填充物主要有分子筛、琼脂糖等。 4.逆流层析法
克隆表达与蛋白质纯化技术
克隆表达与蛋白质纯化技术在生物科学研究领域中，克隆表达与蛋白质纯化技术被广泛应用于蛋白质的生产和研究。克隆表达是指利用重组DNA技术将目标基因导入宿主细胞，并使其在宿主细胞中表达出来。蛋白质纯化则是指从克隆表达的细胞中提取和纯化目标蛋白质。本文将介绍克隆表达与蛋白质纯化技术的基本原理和常用方法。 一、克隆表达技术 克隆表达是将感兴趣的基因克隆到表达载体中，通过转染或转化的方式导入细胞中，从而使该基因在细胞内得以表达。克隆表达技术可分为原核细胞系统和真核细胞系统两类。 1. 原核细胞系统 原核细胞系统中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌。在克隆表达中，大肠杆菌是最常用的宿主细胞，其原因在于其繁殖速度快、易于培养和转化、表达效率高等优点。酵母菌则常用于表达更复杂的蛋白质，因其能够进行糖基化等真核细胞系特有的修饰。 2. 真核细胞系统 真核细胞系统中，常用的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等。哺乳动物细胞系统具有许多优点，如蛋白质修饰和折叠更接近自然情况、大容量表达等，然而其表达成本较高。昆虫细胞和植物细胞则在表达规模较大的蛋白质时较为常用。
二、蛋白质纯化技术 蛋白质纯化是将表达系统中产生的混合蛋白质与其他组分分离的过程，常用的方法有离子交换色谱、亲和层析、凝胶过滤、透析等。 1. 离子交换色谱 离子交换色谱是根据蛋白质在离子交换柱中与其反离子交换作用力的不同而进行分离纯化的方法。常用的离子交换介质有阴离子交换柱和阳离子交换柱。对于不同电荷性质的蛋白质，可以选择合适的离子交换柱实现分离纯化。 2. 亲和层析 亲和层析是利用相互作用力将目标蛋白质与其他组分分离的方法。常见的亲和层析方法包括金属亲和层析、抗体亲和层析等。通过对目标蛋白质与特定亲和剂的亲和力进行结合，实现其与其他蛋白质的分离。 3. 凝胶过滤 凝胶过滤是利用凝胶材料的大小选择性分离蛋白质的方法。将混合蛋白溶液经过凝胶柱时，大分子量的蛋白质会被阻滞在柱内，而小分子量的蛋白质则可以通过柱床。通过此方法，可以实现对不同分子量蛋白质的分离纯化。 4. 透析
蛋白质表达和纯化技术的研究与应用
蛋白质表达和纯化技术的研究与应用 近年来，蛋白质表达和纯化技术日益成熟和受到重视，其在生物医药、工业化学等领域的应用也越来越广泛。本文将从蛋白质表达和纯化的基本概念入手，论述其研究和应用，并探讨其未来发展趋势。 一、蛋白质表达和纯化的基本概念 蛋白质表达是指通过基因工程手段使目标蛋白在细胞内或细胞外进行表达的过程。一般来说，蛋白质表达可以分为原核细胞和真核细胞表达两种方式。其中，原核细胞表达利用大肠杆菌等细菌作为表达宿主，而真核细胞表达则通常采用哺乳动物细胞或酵母细胞。 蛋白质纯化则是指通过一系列化学、物理等方法将目标蛋白从混合样品中分离出来的过程。纯化的方法包括离子交换、亲和层析、凝胶过滤等。其中，亲和层析是一种常用的手段，其利用蛋白质与配体之间的非共价相互作用，如亲和性，选择性地将目标蛋白从混合物中分离出来。 二、蛋白质表达和纯化的研究和应用 蛋白质表达和纯化技术的研究和应用已经广泛地涉及到生物医药、食品加工、饲料添加剂等多个领域。下面会分别从三个方面来介绍其应用。 1、生物医药领域 在生物医药领域中，蛋白质表达和纯化技术在制备重组蛋白、生产多肽类激素等方面发挥着重要的作用。例如，通过表达重组人胰岛素，可以生产出纯化的胰岛素产品，治疗糖尿病等疾病。此外，利用这种技术可制备重组人影响素和重组人乙肝疫苗等生物制品，广泛地应用于临床治疗。 2、食品加工领域
蛋白质在食品加工领域中也有很大的应用。采用蛋白质表达和纯化技术，可以 制备豆腐、酱油等大豆制品，以及某些膳食营养补充剂等。通过提高食品加工中的蛋白质含量和纯度，可以改善食品的质量和味道，增加其营养价值。 3、饲料添加剂领域 蛋白质表达和纯化技术在饲料添加剂领域的应用也比较广泛。通过制备高纯度 的饲料添加剂，可以提高家禽、水产养殖等养殖业的生产效率，降低养殖成本。同时，蛋白质在饲料添加剂中也起到了相当重要的营养作用，能够有效地提高动物的生长速度和肉质质量。 三、蛋白质表达和纯化技术的未来发展趋势 目前，蛋白质表达和纯化技术还存在一些不足，例如表达效率不高、蛋白质结 构易受到环境的影响等问题。未来，随着生物医药和食品工业的发展，蛋白质表达和纯化技术也会得到进一步优化和创新。 一方面，关注蛋白质结构解析技术的研究和应用，可从分子水平上了解蛋白质 的工作原理和性质，为蛋白质表达和纯化技术的改进提供理论和科学支持。另一方面，利用基因编辑、创新表达细胞系等手段，继续提高表达效率、减小蛋白质受到环境影响的程度，促进蛋白质表达和纯化技术的进一步发展和应用。 总之，蛋白质表达和纯化技术已经成为一个快速发展和广泛应用的领域。未来，它将继续发挥着重要的作用，为医学、食品等领域的发展带来更多的机会和挑战。
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化 原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定 之一原核表达 一( 实验材料 1.大肠杆菌BL21.DH5a 2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用 3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用 4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的 。 IPTG浓度为0.8m/mL 5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20?贮存。常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20?贮存。常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。加入650mL的去离子水，均匀搅拌。用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O 10mL,充分混合后使用。 9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。 10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。 Tris 15.1g;Glycine 94g ;SDS 5.0g;加入约800mL的去离子水，搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。 二( 实验原理 大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质。实验室常采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达，不同 的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。三( 操作程序及结果判定 (一)构建重组表达载体 1、载体酶切:将原核表达载体(例如:pET-28a)用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的载体大片段。 2、PCR产物双酶切后经DNA纯化与回收试剂盒(或者切胶回收)回收后，同样在用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的片段。 注:一般需要先连T载体克隆增值，然后再连原核表达载体。 (二)获得含重组表达质粒的表达菌种
蛋白质表达及纯化策略
蛋白表达及纯化策略 一.目录： 含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化 GST-融合蛋白的纯白化策略 DEAE纯化蛋白策略 分子筛纯化蛋白策略 二.试剂： 所用试剂均购自上海生工 三.资料来源： 汪德强老师 四.撰写： 罗淼牛司强 含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂：1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中，37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各 10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550
＝0.1-1.0）。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5， 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1 分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE 观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。 2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L 的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小 时，至对数生长中期。 3.以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋 白。 4.收集菌液，4℃，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，－70℃保 存。 三.细菌破碎和蛋白质溶解 所需特殊试剂： 非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0 超声破碎液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0