血液密度梯度离心
利用密度梯度离心法从人外周血分离单核巨噬细胞
Contents1. Reagent and instrument requirements2. Protocols2.1 Schematic figure of a density gradient centrifugation2.2 Isolation of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) using Ficoll-Paque™2.3 Isolation of PBMCs using Ficoll-Paque™ and aLeucosep® Tube1. Reagent and instrument requirements●Buffer: Prepare a solution containing phosphate-buffered saline(PBS), pH 7.2, and 2 mM EDTA. Keep buffer cold (2−8 °C).▲Note:EDTA can be replaced by other supplements such as anticoagulant citrate dextrose formula-A (ACD-A) or citrate phosphate dextrose (CPD).●15 mL of Ficoll-Paque™ (ρ = 1.077 g/mL).●For protocol 2.2: Leucosep® Tube (# 227 290, Greiner Bio-OneGmbH).2. Protocols2.1 Schematic figure of a density gradient centrifugation2.2 Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)using Ficoll-Paque™▲This protocol is optimized for the preparation of PBMCs from human blood. For the preparation of PBMCs from rhesus monkey (Macaca mulatta) or cynomolgus monkey (M. fascicularis) blood, it is recommended to use 96% Ficoll-Paque™.▲The peripheral blood or buffy coat should not be older than 8 hours and supplemented with anticoagulants (e.g. heparin, EDTA, citrate, ACD-A, or citrate phosphate dextrose (CPD)). 1. Dilute cells with 2–4× the volume of buffer.▲Note: The more diluted the blood sample, the better the purity of the mononuclear cells.2. Carefully layer 35 mL of diluted cell suspension over 15 mL ofFicoll-Paque in a 50 mL conical tube.3. Centrifuge at 400×g for 30–40 minutes at 20 °C in a swinging-bucket rotor without brake.4. Aspirate the upper layer leaving the mononuclear cell layer(lymphocytes, monocytes, and thrombocytes) undisturbed at the interphase.5. Carefully transfer the mononuclear cell layer to a new 50 mLconical tube.6. Fill the conical tube with buffer, mix, and centrifuge at 300×g for10 minutes at 20 °C. Carefully remove supernatant completely.7. For removal of platelets, resuspend the cell pellet in 50 mLof buffer and centrifuge at 200×g for 10–15 minutes at 20 °C.Carefully remove the supernatant completely.▲Note: This step will increase the purity of the target cells in the subsequent MACS® Cell Separation.8. Repeat step 7. Most of the platelets will remain in the supernatantupon centrifugation at 200×g.9. Resuspend cell pellet in an appropriate amount of buffer andproceed to magnetic labeling. For details see MACS Cell Separation Reagents data sheets.▲Note: PBMCs may be stored in the refrigerator overnight in PBS containing0.5% BSA or autologous serum. Do not store cells longer than one day in therefrigerator. Wash at least once before proceeding to magnetic labeling and resuspend cells in an appropriate buffer. For details see MACS Cell Separation Reagents data sheets.2.3 Isolation of PBMCs using Ficoll-Paque™ and aLeucosep® Tube▲The peripheral blood or buffy coat should not be older than 8 hours and should be supplemented with anticoagulants (e.g. heparin, EDTA, citrate, ACD-A, or citrate phosphate dextrose (CPD)).1. Dilute cells with 2–4× the volume of buffer.▲Note: The more diluted the blood sample, the better the purity of the mononuclear cells.2. Pipette 16 mL of Ficoll-Paque™ into a Leucosep® Tube. Closethe tube and centrifuge at 1000×g for 30 seconds at 20 °C. The Ficoll-Paque is now located below the porous barrier.3. Transfer diluted cell suspension into the prepared LeucosepTube and fill up with buffer to a total volume of 50 mL.4. Centrifuge at 1000×g for 10 minutes at 20 °C in a swinging-bucket rotor without brake.Miltenyi Biotec GmbHFriedrich-Ebert-Straße 68, 51429 Bergisch Gladbach, Germany Phone +49 2204 8306-0 Fax +49 2204 85197macs@miltenyibiotec.de Miltenyi Biotec Inc.12740 Earhart Avenue, Auburn CA 95602, USAPhone 800 FOR MACS, +1 530 888 8871 Fax +1 530 888 8925macs@page 1/2P0001.02Isolation of mononuclear cells from human peripheral blood by density gradient centrifugationUnless otherwise specifically indicated, Miltenyi Biotec products and services are for research use only and not for diagnostic or therapeutic use.5. Three layers occur above the barrier: a plasma layer, theinterphase consisting of PBMCs, and a small layer of Ficoll-Paque. Discard the plasma layer. 6. Transfer the interphase above the barrier, which contains thePBMCs, to a new 50 mL conical tube. 7.Fill the conical tube with buffer, mix, and centrifuge at 300×g for 10 minutes at 20 °C. Carefully remove supernatant completely.8. For removal of platelets, resuspend the cell pellet in 50 mLof buffer and centrifuge at 200×g for 10–15 minutes at 20 °C. Carefully remove the supernatant completely. 9. Repeat step 8. Most of the platelets will remain in thesupernatant upon centrifugation at 200×g.10. Resuspend cell pellet in an appropriate amount of buffer andproceed to magnetic labeling. For details see MACS Cell Separation Reagents data sheets.▲ Note: PBMCs may be stored in the refrigerator overnight in buffer. Do not store cells longer than one day in the refrigerator. Wash at least once before proceeding to magnetic labeling and resuspend cells in an appropriate buffer. For details see MACS Cell Separation Reagents data sheets.All protocols and data sheets are available at .MACS is a registered trademark of Miltenyi Biotec GmbH.Ficoll-Paque is a trademark of GE Healthcare companies.Leucosep is a registered trademark of Greiner Bio-One GmbH.Unless otherwise specifically indicated, Miltenyi Biotec products and services are for research use only and not for diagnostic or therapeutic use.Copyright © 2008 Miltenyi Biotec GmbH. All rights reserved.page 2/2P0001.02。
密度梯度离心（density
密度梯度离⼼（density gradient centrifuge）⼀、概论在密度梯度离⼼中单⼀样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离⼼本经的增⼤⽽增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离⼼过程中⾃形成，经常，密度梯度的可以分为：速率⼀区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离⼼。
在速率⼀区带离⼼中混合样品的以很薄的⼀层铺在梯度液的上部，在离⼼过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，⽽在离⼼的某⼀时刻形成了数个含左第⼀级份颗粒的"区带"。
离⼼过程在最垂"的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停⽌了。
样品在离⼼后与梯度液⼀起收集，⽤常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。
每个单⼀组份的沉降速率取决于它们的形状、尺⼨、密度、离⼼⼒的⼤⼩、梯度液的密度和粘性系数。
对于相类似的⽣物体组份常常形状也相似。
在速率区带离⼼中我们常常使梯度液的最⼤密度不超过样品在该梯度中浮密度。
利⽤这类⽣物组份在尺⼨上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某⼀特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停⽌离⼼即可以达到分离⽬的。
与速率⼀区带离⼼法不同的是，等密度离⼼是依赖于样品颗粒的不同密度来进⾏离⼼分离的。
混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚⾄和梯度液混在⼀起。
最后⼀种⽅法依靠离⼼⼒来形成梯度（⾃形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单⼀成份向它们⾃⼰的等密度区靠扰即达到了分离纯化的⽬的。
对于速率⼀区带离⼼，梯度液最⼤密度⼀般⼩于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；⽽等密度离⼼法中，梯度液的初始最⼤密度常常超过样品各组份的密度，利⽤每个单⼀组份沉降或上浮到它们各⾃的等密度区来达到分离的⽬的。
密度梯度离⼼法的理论依据是（参考⽂献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某⼀时刻样品的沉降速度（厘⽶/秒）d：样品颗粒的直径（厘⽶），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。
密度梯度离心名词解释
密度梯度离心名词解释
密度梯度离心，常缩写为DGC，是一种通过样品的中性渗透性梯度、密度梯度和相对质
量含量来分离和浓缩悬浮液中微粒或颗粒物质的技术。
它能有效地分离、浓缩不同相对分子质量的乳衣质悬浮体，可用于分离膜蛋白、复合蛋白等含量较低的悬浮体或蛋白复合物。
原理：密度梯度离心是一种分离乳衣质悬浮体的技术，它利用不同物质在密度梯度和中性渗透性梯度中的分子质量的差异来分离它们。
当悬浮体被加入至含有密度梯度溶液的离心管时，根据其相对质量、物质特性和环境因素，物质从顶部被运动到等密度区的特定深度，在这一深度，物质从其稳定的位置到达某一重力稳定层，这一稳定层会受到重力的作用，因而形成稳定悬浮中的物质和离轴移动的一些物质之间的界限，最终可以形成相异物质的稳定层，从而实现分离。
DGC在生物分离和分析领域有着广泛的应用。
它被广泛用于大分子的分离、富集、测定等，如生物聚合物如蛋白质、复合蛋白质、多糖、细胞表面抗原，也可以用来研究细胞膜等生物体的性质和结构，以及细胞膜表面相关的复杂生物过程。
DGC也可以用来研究病毒及其表面糖蛋白，同时，DGC也用来研究宿主抗体对病毒的亲
和力，及病毒被宿主细胞吸收入内后的变化及作用机制等。
此外，DGC也可以分离分析药物、抗药性物质及药物的低毒副作用的发生机制等，它还
可以广泛用于能源和材料方面的研究。
总之，密度梯度离心是一种有效的分离乳衣质悬浮体的技术，此外，它还被广泛用于生物学、药物研究以及能源和材料方面的研究，其中包括分离病毒及其表面糖蛋白、研究药物的低毒副作用及能源材料的性质和结构等，由此可见，密度梯度离心技术的广泛应用已经为生命科学及医药贡献了重要功能。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个有点“高大上”的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
别担心，听起来复杂，但其实就像是把水果分开一样，方法有点多，但都不是很难。
首先，单个核细胞是什么呢？简单来说，它们是血液里的小战士，负责咱们身体的免疫系统工作。
而把这些小战士从血液中分离出来，是为了让我们能更好地研究它们，或者用于治疗各种病症。
现在，让我们一起来看看，这个过程到底怎么做吧！2. 准备工作2.1 收集血液样本首先，得从患者或志愿者那里收集血液。
想象一下，这就像是收集原材料一样。
我们一般用专门的血液收集管，这些管子里有点抗凝剂，防止血液在管子里凝固。
这个步骤就像是给血液穿上“防寒衣”，确保它们不会在实验室里冻住。
血液收集后，我们需要立即将其送到实验室，因为血液可不像冰淇淋那样能在冰箱里存放很久。
2.2 准备离心机接下来，我们用离心机来分离这些细胞。
离心机是一种可以快速旋转的机器，通过离心力把血液中的不同成分分开。
这个过程就像是在一个大旋转舞台上，血液里的各种“演员”根据他们的“舞姿”被分到不同的区域。
大家可以把离心机想象成一个超级有力的“旋转木马”，它能把血液中的细胞按类型分类开来。
3. 分离过程3.1 使用密度梯度离心法密度梯度离心法是我们分离单个核细胞的绝招之一。
我们在试管里加入一个特殊的液体，这个液体的密度不同层次逐渐增加，形成一个梯度。
然后把血液样本倒进去，接着用离心机旋转。
这就像是给试管里制造了一条“滑梯”，细胞们就沿着这个“滑梯”滑到它们各自的位置。
单个核细胞会在某一层次上停下来，其他细胞则会分布在不同的层次上。
3.2 清洗与收集当我们分离好细胞后，下一步就是清洗和收集。
用生理盐水或者其他洗涤液把细胞洗干净，去掉多余的杂质。
这个过程就像是给细胞洗个澡，确保它们干干净净，然后我们把这些清洗好的细胞取出来。
然后就可以把这些细胞用于各种研究或治疗了。
4. 结束语好了，今天的分享就到这里。
富血小板血浆密度梯度离心
富血小板血浆密度梯度离心
首先，让我们来解释一下什么是富血小板血浆密度梯度离心。
这种技术是利用密度梯度离心原理，通过在离心管中建立不同密度的梯度，使得血液中的不同成分在不同密度的梯度中沉降，从而实现血小板的分离。
通常使用的离心介质包括离心管底部的高密度介质和上层的低密度介质，血液在离心过程中会在不同密度的介质中分层，从而使得血小板得以分离。
其次，我们来探讨一下富血小板血浆密度梯度离心的步骤。
首先，需要准备离心管和密度梯度离心介质，然后将血液样本加入离心管中。
接下来进行离心过程，离心机会以高速旋转使得血液中的不同成分在离心管中分层。
在离心结束后，可以看到不同层次的血液成分，通过取下层的富含血小板的血浆进行收集，从而得到富血小板的血浆样品。
另外，我们还可以从应用角度来讨论富血小板血浆密度梯度离心的意义。
这种技术可以用于临床医学中，例如在血液病学和输血医学领域。
通过富血小板血浆密度梯度离心，可以获得富含血小板的血浆样品，这对于临床上的血小板治疗和研究具有重要意义。
总的来说，富血小板血浆密度梯度离心是一种重要的血液分离技术，通过利用密度梯度离心原理，可以有效地分离富含血小板的血浆样品，具有广泛的应用前景。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
血液差速离心法和密度梯度离心法
血液差速离心法和密度梯度离心法血液差速离心法和密度梯度离心法，这俩听起来是不是有点高深莫测？它们在科学研究和医学检测中可真是大显身手的“好帮手”。
想象一下，血液就像一大碗色拉，里面有各种各样的成分。
有红细胞、白细胞，还有血小板，甚至还有液体部分的血浆。
我们如果想知道这些成分的秘密，就得用上这些离心法了，真的是一门技术活儿。
先说说血液差速离心法。
这种方法就像是在给血液进行“分类大赛”，不同的成分根据重量和密度在离心机里被甩得四分五裂。
想象一下，把一堆玩具扔进洗衣机，轻轻一甩，重的沉底，轻的漂浮在上面。
离心机就像那洗衣机，利用高速旋转的力量，把血液里的成分们一一分开。
嘿，红细胞和白细胞像老朋友一样，互相拥抱，但经过几轮旋转，它们也不得不乖乖分开。
这种方法速度快，效果也不错，适合咱们想要快速搞定实验的时候。
再说说密度梯度离心法，这个名字听起来更复杂，对吧？但其实它就像是在给血液上了“密度的考卷”。
在离心管里，咱们会先放一些不同浓度的液体，就像做蛋糕时分层的糖浆。
然后再把血液倒进去，开动离心机。
随着转速的提高，血液里的成分会根据密度逐渐沉降，每个成分都找到自己最舒服的位置，就像不同的鱼在水中游一样。
重的成分沉到底下，轻的漂在上面，真是让人感叹自然的神奇。
这两种方法各有千秋，差速离心法更适合快速检测，而密度梯度离心法则能帮助我们更精准地分析成分。
就像开车，有的路走得快，有的路走得稳。
两者结合使用，简直就是科学研究的“黄金搭档”。
这俩方法可不仅限于血液，其他生物样本也能用，真是万金油。
不过，做实验的时候可得小心翼翼，别让样本受了委屈。
细胞在离心的过程中，容易受损，就像蛋糕没做好的话，容易塌陷。
所以，操作的时候要注意转速和时间，不然一不小心，就可能得不偿失。
科学研究可是个严谨的活，容不得半点马虎。
毕竟，谁也不想把自己的实验搞成“乌龙事件”。
现在，咱们再聊聊这两种方法的应用。
比如在医院里，医生可不希望在急救时搞错病人的血型，对吧？所以，利用差速离心法就能快速分离出红细胞，准确判断。
密度梯度离心与差速离心的区别
密度梯度离心与差速离心的区别
密度梯度离心属于密度萃取，是根据溶质和溶液的密度差异来实现分离的，是在高细胞压力的作用下，在容积较大的离心管中利用液体单位体积的重量（密度）差异进行分离；而差速离心是基于离心力的不同，即根据溶质的分子量和浓度的差异，从而使得这一溶液的相对离心力差异改变而实现分离，利用的是两液体的离心力差异。
2、分离效率不同
密度梯度离心的效率一般比较低，它主要利用液体单位体积的重量差异，物质分子量的差异较小，溶液浓度的差异也较小，因此分离效率不会高。
而差速离心可以实现高密度的湍流而高速度的分离，分离效率更高。
三、应用不同
密度梯度离心主要用于对分子量大的物质进行分离，如生物体分离，尤其是细胞分离，可以达到更高的精度；而差速离心可以用于分离分子量小的有机物，如分离水溶性有机物、抗体和抗原之间的结合等。
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血液密度梯度离心
血液密度梯度离心（Blood density gradient centrifugation，BDGC），是一种用于分离血液中不同细胞类型的技术。
该技术基于血液中不同细胞类型的密度不同，通过采用不同密度的介质制成梯度，再将样品加入梯度中进行离心，就能使细胞按密度不同分布于梯度的不同层中，从而实现分离。
该技术广泛应用于临床检验、科研以及生物制药等领域。
BDGC可以用于分离血液中的各类细胞，如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞等，并且还可用于富集特定的细胞亚群，如淋巴细胞的T细胞、B细胞、NK细胞等。
使用该技术分离出的纯净细胞亚群，可以用于研究这些细胞的生物学特性、功能、代谢等方面的问题。
BDGC的实验原理是将血液样品加入密度梯度离心管中，通常是由高密度到低密度浓度逐渐降低的梯度，如离心管中按高密度到低密度依次加入20%的高山黄、10%的无聚丙烯酰胺凝胶和50%的淋巴细胞分离液。
然后，将管子放入离心机中，以一定转速离心，离心时间一般在30分钟左右，待离心结束后，可以看到细胞沉积在不同梯度中的不同层中，从而进行细胞层的收集。
BDGC的优点在于该技术非常灵活，可以根据需要选择不同类型的梯度介质，并且可以调整离心条件（如离心转速、离心时间等）来达到不同的细胞分离目的。
此外，BDGC分离出来的细胞亚群纯度高，适合于进一步的实验研究和应用。
BDGC的缺点在于分离过程时间较长，需要几十分钟或者更长时间进行离心，在这个过程中需要维持离心速度、离心时间和温度等条件的稳定性。
并且离心过程也可能对细胞造成损伤，影响细胞的活性和功能。
另外，该技术的价格不菲，需要昂贵的离心设备、介质和试剂等。