分子生物学 Ch12-tan 基因诊断与基因治疗
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12基因诊断与基因治疗
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链
将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。
优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。
（三）基因测序
是最直接、最准确的基因诊断技术
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常
对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。
GAG——GTG Glu——Val
已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG
CCTGTGG 突变后不能识别 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。
Southern blot
（二）PCR技术
巢式PCR 多重PCR RT-PCR 实时PCR 联合PCR
mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，
是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中 也存在反义RNA。
特点 （l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用 于特异的mRNA 分子，不改变所调节基因的结构。反 义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解， 不留“残渣” （2）设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （ 4 ）在治疗 RNA 病毒感染性疾病时有更大的优势。 能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖
靶细胞 载体 目的基因
in vivo
（五）治疗基因表达的检测
无论以何种方法导入基因，都需要检
测这些基因是否能被正确表达。被导入基
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
可以用DNA印迹技术进行分析。
将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。
优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。
（三）基因测序
是最直接、最准确的基因诊断技术
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常
对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。
GAG——GTG Glu——Val
已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG
CCTGTGG 突变后不能识别 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。
Southern blot
（二）PCR技术
巢式PCR 多重PCR RT-PCR 实时PCR 联合PCR
mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，
是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中 也存在反义RNA。
特点 （l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用 于特异的mRNA 分子，不改变所调节基因的结构。反 义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解， 不留“残渣” （2）设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （ 4 ）在治疗 RNA 病毒感染性疾病时有更大的优势。 能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖
靶细胞 载体 目的基因
in vivo
（五）治疗基因表达的检测
无论以何种方法导入基因，都需要检
测这些基因是否能被正确表达。被导入基
因的表达状态可以用 PCR 、 RNA 印迹、
蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导
入基因是否整合到基因组以及整合的部位，
可以用DNA印迹技术进行分析。
分子生物学Ch12tan基因诊断与基因治疗
• 关于多态性分析
• 基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。 • DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•1、限制性片段长度多态 性（restriction fragment
•2. 地贫 •(1)-地贫 •1）DNA检测与分析 •（a）RFLP •（b）PCR •2）RNA检测与分析
• RT-PCR
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
•（2）-地贫的基因诊断 •1) DNA检测与分析 •（1）PCR-探针法 •（2）PCR-RFLP连锁分析法 •（3）DNA芯片技术 •2)RNA检测与分析
• 疾病种类：X染色体连锁性
遗传病
• 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基
因
•
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主要临床表现：出血性疾 分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
• 应用PCR-RFLP连锁分析法
诊断甲型血友病
• 用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片
断，该片断含一个BclⅠ多态性位
点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切
五、感染性疾病的基因诊断
n 目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
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分子生物学Ch12tan基因诊断与基因 治疗
应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
•点样
分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗
第五章 基因诊断和基因治疗
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
基因诊断
应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平 检测分析致病基因的存在、变异和表达 状态从而对疾病作出诊断的诊断技术
诊断技术进展
细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代
以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质 分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代
（一）原位（in situ）杂交
不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固 定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜 上）与标记核酸探针杂交。可测知特定 基因的存在或表达状况。还可观察被测 基因在细胞内或染色体上的定位。
（二）斑点印迹（Dot blot） 杂交
把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸 纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸 探针杂交。可检测特定基因的存在或表 达情况。
Southern印迹杂交
系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后， 再转移至膜上与标记探针杂交的一种核 酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏 感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物 总基因组中的单拷贝基因。主要用于检 测基因组中特定的基因或序列。
Northern印迹杂交
是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记 核酸探针杂交的技术。是分析基因表达 水平的主要技术之一。它可定性、定量 测知某一特定基因的表达情况。
（三）PCR-SSCP
该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基） 有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。
这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单 链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序 列有无变异。
基因诊断与基因治疗
基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗能够在比较短的时刻从理论设想变为现实，要紧是由于分子生物学的理论及技术方法，专门是重组DNA技术的迅速进展，使人们能够在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。
因此对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。
因此在20世纪70年代末产生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。
可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。
•基因诊断o基因诊断的含义传统对疾病的诊断要紧是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的专门结果，然而表型的改变在许多情形下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时刻后才显现，因此常不能及时作出明确的诊断。
现知各种表型的改变是由基因专门造成的，也确实是讲基因的改变是引起疾病的全然缘故。
基因诊断是指采纳分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否专门，以此来对相应的疾病进行诊断。
基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。
基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，能够揭示尚未显现症状时与疾病有关的基因状态，从而能够对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和推测，专门对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
o基因诊断的原理及方法（一）基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能专门有关。
基因诊断的差不多原理确实是检测有关基因的结构及其表达功能专门是RNA产物是否正常。
由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成有关基因结构变异，因此，能够直截了当检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这确实是DNA诊断。
对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。
基因诊断与基因治疗2
DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不 同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶 中的构象不同（单链构象多态性），利用 迁移率的差别可使各种序列不同的单链分 离开来。
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
1. RT-PCR
2. 荧光定量PCR
荧光标记引物
3. 多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
4. PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）
ASO1 ASO2 N H M
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
（三）单链构象多态性分析
（single-strand conformation polymorphism, SSCP）
3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤 维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基 因及其表达产物的定性及定量的研究。
4. 反向斑点杂交（reverse dot blotting）
先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙 膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂 交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能 检测一种样品的局限，大大提高了基因诊 断的效率。
提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生 特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处 理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标 记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信 号。
2. Northern印迹杂交(Northern blotting)
RNA 经 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 ， 转 移 到固相支持物上，通过分子杂交检测特定 的mRNA分子的含量与大小。
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
1. RT-PCR
2. 荧光定量PCR
荧光标记引物
3. 多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
4. PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）
ASO1 ASO2 N H M
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
（三）单链构象多态性分析
（single-strand conformation polymorphism, SSCP）
3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤 维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基 因及其表达产物的定性及定量的研究。
4. 反向斑点杂交（reverse dot blotting）
先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙 膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂 交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能 检测一种样品的局限，大大提高了基因诊 断的效率。
提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生 特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处 理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标 记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信 号。
2. Northern印迹杂交(Northern blotting)
RNA 经 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 ， 转 移 到固相支持物上，通过分子杂交检测特定 的mRNA分子的含量与大小。
知识点2 基因诊断和基因治疗
表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。 目前基因治疗多采用此种方式。 ④基因失活：早期一般是指反义核酸技术。它是将特定 的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和核酶导入细胞，
在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又
有反基因策略、肽核酸、基因去除和RNA干扰技术。
（2）基因治疗的两种途径
（3）科学家对基因治疗发展的推测
①随着电脉冲技术的完善和表达调控系统的突破，基因 药物，即基因DNA通过肌肉导入而表达并分泌其蛋白产 物，将成为基因工程多肽药物的重要竞争者和基因治疗 延伸的重要领域。
②随着技术的发展，不少非分泌性蛋白也将可以组建
融合基因，从而通过基因工程表达，形成新的基因工
程多肽药物。届时，基因治疗和基因工程的相互竞争 局面将会出现。最终的结果，可能以各种基因的具体 情况来判断孰优孰劣。
（1）目前基因治疗所采用的方法 ①基因矫正：将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常
部分予以保留。
②基因置换：用正常基因通过体内基因同源重组，原位 替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复 正常状态。
③基因增补：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不
去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其
知识点2
基因诊断和基因治疗பைடு நூலகம்
要 点 归 纳
1.基因诊断
基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的
技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常， 从而对疾病作出诊断的方法。
（1）基因诊断的特点
①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，
针对性强。 ②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的 特异性。 ③分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度 很高。 ④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为
分子生物学 Ch12-tan 基因诊断与基因治疗
Val
MstⅡ酶切位点
MstⅡ酶
A T替换 CCTNAGG
CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG------MstⅡ MstⅡMstⅡ 1.1kb 0.2kb
HbS ---------CCT GTG GAG-------
1.3kb
SS AS F AA
1.3kb 1.1kb 0.2kb
第十六章
基因诊断与基因治疗 Gene diagnosis and gene therapy
基因诊断的概念：
以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
DNA指纹分析
血迹中的DNA
第二节 基因治疗 Gene therapy
基因治疗的概念 基因治疗是指把目的基因导入人体，
通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不 表达或低表达、或已异常突变而不表达 的基因，或采用特定方式关闭、抑制异 常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗 方法。
一、基因治疗的必要条件
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP
2、特点 （1）宿主范围广 （ 2 ）腺病毒蛋白表达不以宿主 增殖为必要条件 （ 3 ）可获得高病毒效价 （ 4 ）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性 （7）无包膜，不易被补体灭活， 可直接在体内应用 （8）不整合入染色体
医学分子生物学 第三部分 基因诊断和基因治疗 共66页
第三部分 基因诊断与基因治疗
1
第一节 基因诊断
一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检
查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常， 对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。
2
基因诊断的特点
特异性强，可对患者作出诊断，可检测致病基因的 携带者，某些基因的易感者。
杂交技术和PCR技术具有放大效应，灵敏度高。
39
操作： 提DNA
多重PCR
电泳
分析
优点：STR分布于整个基因组中， 故可分析部分降解样品。 简单、方便。
40
2019年Lins对12个STR位点进行复合扩增， 个体匹配几率小于3.3×10-12。
目前已有13个STR位点，进行复合扩增。
STR-PCR技术在法医学的个人识别和亲子鉴 定中已逐步占主导地位。
45
（二）基因添加augmentation
• 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基 因，而细胞缺陷的基因并未除去,通过导入的 正常基因表达正常的产物，从而补偿缺陷基因 的功能。
• 二是向靶细胞中导入它本来不表达的基因或没 有的基因，利用其表达产物达到基因治疗的目 的。
46
（三）基因干预interference
（2）northern杂交
（3） dot blotting 斑点杂交 1981 Dot blot和Slot blot:将 DNA或RNA不经消化和电泳，变性后直接点样于NC膜或尼 龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性定量研究.
反向斑点杂交
4
Southern印迹杂交法 内切酶
1 2M
基因组DNA
17
A B C
D
A：CD17 (A→T)
1
第一节 基因诊断
一、基因诊断的概念 基因诊断：它是以DNA和RNA为诊断材料，通过检
查基因（内源、外源）的存在、缺陷或表达异常， 对人的状态和疾病作出诊断的方法和过程。
2
基因诊断的特点
特异性强，可对患者作出诊断，可检测致病基因的 携带者，某些基因的易感者。
杂交技术和PCR技术具有放大效应，灵敏度高。
39
操作： 提DNA
多重PCR
电泳
分析
优点：STR分布于整个基因组中， 故可分析部分降解样品。 简单、方便。
40
2019年Lins对12个STR位点进行复合扩增， 个体匹配几率小于3.3×10-12。
目前已有13个STR位点，进行复合扩增。
STR-PCR技术在法医学的个人识别和亲子鉴 定中已逐步占主导地位。
45
（二）基因添加augmentation
• 一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基 因，而细胞缺陷的基因并未除去,通过导入的 正常基因表达正常的产物，从而补偿缺陷基因 的功能。
• 二是向靶细胞中导入它本来不表达的基因或没 有的基因，利用其表达产物达到基因治疗的目 的。
46
（三）基因干预interference
（2）northern杂交
（3） dot blotting 斑点杂交 1981 Dot blot和Slot blot:将 DNA或RNA不经消化和电泳，变性后直接点样于NC膜或尼 龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性定量研究.
反向斑点杂交
4
Southern印迹杂交法 内切酶
1 2M
基因组DNA
17
A B C
D
A：CD17 (A→T)
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引物3
5、基因扩增的诊断
常采用Southern印迹杂 交定量法
关于多态性分析
基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。
DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
1、限制性片段长度多态性 （restriction fragment
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP
正常男性 先证者
142bp 99bp
女性携带者 胎儿绒毛样品
2、DNA重复序列多态性分析
（三）基因表达异常的诊断 1、mRNA的定量分析 （1）相对定量
斑点杂交
RT-PCR （2）绝对定量
2、mRNA长度分析 Northern印迹杂交
RT-PCR
三、遗传病的基因诊断
1、直接诊断策略 2、间接诊断策略
（2）可使靶细胞变成稳定表达 目的基因的转化细胞；
（3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率 非常高；
（5）不感染非增殖细胞。
4、安全性问题 （1）感染的可能性 （2）污染的可能性 （3）在靶细胞基因组中的整合
（二）腺病毒载体 1、结构
E1A E1B L1~L5 E2B
E3
E2A
E4
（四）转染靶细胞的筛选和导 入基因的鉴定
1、选择靶细胞应考虑因素 （1）组织特异性细胞； （2）易获得、寿命长 （3）离体细胞易受外源遗传物 质转化；
（4）易成活。
2、常用 靶细胞
（1）造血细胞 （2）皮肤成纤维细胞 （3）肝细胞 （4）血管内皮细胞 （5）淋巴细胞 （6）肌肉细胞 （7）肿瘤细胞 （8）其他细胞
矫正突变碱基，精确的原位修复 最理想，难以实现
(二)基因置换
指将特定的目的基因导入特定的细胞， 通过定位重组，以导入基因置换基因组 内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组）
（三）基因增补
1、概念 通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不
表达的基因。 2、基因添加的两种类型 （1）针对特定的缺陷基因导入其相应正
常基因 （2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表
达的基因
（四）基因干预
采取特定的方式抑制某个基因的表达，或 通过破坏某个基因使之不表达
1.反义核酸技术 2.核酶 3.RNA干扰技术（RNAi)
三、基因治疗的基本程序
（一）目的基因的选择和制备
（二）靶细胞的选择
（三）基因的导入 （基因转移技术）
基因治疗的方式： 体内法：体内直接转移基因法
正常基因：设计寡核苷酸探针M GGTACGATGCGGTTAACGCG CCATGCTACGCCAATTGCGC
突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCG CCATGCTACACCAATTGCGC
MN
MN
MN
MN
杂交的结果：
（Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突 变基因纯合子
应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
在感染的发现； 3.大规模病原流行病学的现场筛查 4. 病原体抗药性的快速敏感试验; 5.对微生物的科属种进行准确分类
鉴定; 。
六 基因诊断在法 医学中的应用
PCR结合DNA指纹技术
Southern blot 应用
DNA指纹分析
第十六章
基因诊断与基因治疗 Gene diagnosis and gene therapy
基因诊断的概念：
以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
RT-PCR
C地中海贫血 珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb
Bgl II
A C
Bgl II
（二）血友病A
factor VIII 基因缺陷（碱 基取代、缺失或插入等）
基因产物凝血因子VIII 无 活性或不稳定，导致凝血 障碍。
PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段
Bcl I 限制酶 酶切位点在 基因内18号外显子3´端
（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变
基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变
（2）诊断未知的点突变
常用检测方法：
①PCR-SSCP ②DNA芯片 ③测序
①PCR-SSCP检测法 单链构象多态性
Single strand conformation polymorphism SSCP
2、特点 （1）能够进行位点特异性整合 （2）无致病性 （3）载体结构简单 （4）稳定 （5）不引起肿瘤形成
（四）单纯疱疹病毒载体 1、结构
ab
U1
b`a`c`Us c a
2、特点 （1）滴度高 （2）容量大 （3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达
基因转移的非生物学方法 （一）脂质体 （二）直接注射法 （三）受体介导基因转移技术 （四）其他方法
dsDNA ssDNA
高温变性，快速冰浴
野生型DNA 突变型DNA
点样孔
慢
快 SSCP原理示意图
2、少数核苷酸缺失或插入突 变的诊断
方法同点突变的诊断
3、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用PCR法
致病基因 引物1 引物3
引物4 引物2
4、基因重排（染色体易位）的 诊断
常采用PCR法
引物1 引物2
抑癌基因p53的检测
1、常见突变类型： 点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插 入或缺失
2、常检测方法 （1）PCR-SSCP （2）PCR结合序列分析 （3）PCR-RFLP
五、感染性疾病的基因诊断
目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
MstⅡ酶
A T替换 CCTNAGG
CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG------MstⅡ MstⅡMstⅡ 1.1kb 0.2kb
HbS ---------CCT GTG GAG-------
1.3kb
SS AS F AA
1.3kb 1.1kb 0.2kb
RFLP法检测HbS (放射性自显影图谱)
基本原理 单链DNA在中性溶液中可形 成一定的空间构象，构象与其碱 基顺序相关。因此当单链DNA中 碱基变异时，如碱基替换，它的 空间构象也发生一定变化。这种 现象称为单链构象多态性。
单链DNA在非变性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳时，其迁移率 不仅与链长有关，还与单链 DNA的空间构象有关，因此碱 基变异引起的构象变化也可改 变单链DNA的电泳迁移率。
其产物有详尽的了解，； （3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能
在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留； （4）导入基因能有适度表达； （5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害； （6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制； （7）人类的基因治疗需经过严格审批
二、基因治疗的主要策略
（一）基因修复或基因矫正
电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
142 bp 99 bp
父
母 儿 胎儿 ( 先证者) (女)
四、 肿瘤的基因诊断
一)肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤标记基因或mRNA 2、检测肿瘤相关基因 3、检测肿瘤相关病毒基因
（二） 肿瘤相关基因的检测
ras癌基因的检测
1、常见突变类型： 点突变（突变热点在12、13、61位密码子的 编码区） 2、常用检测方法 （1）PCR-ASO （2）PCR-SSCP
2、特点 （1）宿主范围广 （ 2 ）腺病毒蛋白表达不以宿主 增殖为必要条件 （ 3 ）可获得高病毒效价 （ 4 ）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性 （7）无包膜，不易被补体灭活， 可直接在体内应用 （8）不整合入染色体
（三）腺相关病毒载体 1、结构
ITR
ψ
REP
ITR CAP
AA:正常 SS:HbS纯合子 AS:HbS杂合子 F:被检胎儿
（2）RFLP间接分析法—— RFLP连锁分析法
甲型血友病 疾病种类：X染色体连锁性 遗传病 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因
主要临床表现：出血性疾病
应用PCR-RFLP连锁分析法 诊断甲型血友病
用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片 断，该片断含一个BclⅠ多态性位 点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切 位点，则产生99bp和43bp两个片 断；如果不存在则只有142bp一个 片断。研究证明，142bp片断与甲 型血友病基因连锁。
① 限制酶识别位点发生单
个碱基置换位片断， 即多态位点的有或无。
② 限制酶识别位点之间的 DNA序列缺失、插入或重组， 限制酶识别序列不发生变化， 但它在基因组中的位置发生 了变化。这种多态性可以有 两个或两个以上的等位片断。
RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
二、基因诊断的内容和技术
5、基因扩增的诊断
常采用Southern印迹杂 交定量法
关于多态性分析
基因组的核酸分子碱基排列顺序 在同种生物的不同个体之间或等位基 因之间存在差异的现象称为基因多态 性。
DNA多态性可分为位点多态性 和重复序列多态性两种。
1、限制性片段长度多态性 （restriction fragment
（1） DNA序列测定 （2）核酸分子印迹杂交 （3）聚合酶链反应（PCR）
单链构象多态性检测PCR-SSCP 限切酶酶谱分析PCR-RFLP 随机引物分析 PCR-RAPD （4） DNA芯片技术
针对不同突变类型的基因诊断 技术
1、点突变的诊断 PCR结合点杂交 DNA芯片技术 限制性片断长度多态性分析法RFLP
正常男性 先证者
142bp 99bp
女性携带者 胎儿绒毛样品
2、DNA重复序列多态性分析
（三）基因表达异常的诊断 1、mRNA的定量分析 （1）相对定量
斑点杂交
RT-PCR （2）绝对定量
2、mRNA长度分析 Northern印迹杂交
RT-PCR
三、遗传病的基因诊断
1、直接诊断策略 2、间接诊断策略
（2）可使靶细胞变成稳定表达 目的基因的转化细胞；
（3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率 非常高；
（5）不感染非增殖细胞。
4、安全性问题 （1）感染的可能性 （2）污染的可能性 （3）在靶细胞基因组中的整合
（二）腺病毒载体 1、结构
E1A E1B L1~L5 E2B
E3
E2A
E4
（四）转染靶细胞的筛选和导 入基因的鉴定
1、选择靶细胞应考虑因素 （1）组织特异性细胞； （2）易获得、寿命长 （3）离体细胞易受外源遗传物 质转化；
（4）易成活。
2、常用 靶细胞
（1）造血细胞 （2）皮肤成纤维细胞 （3）肝细胞 （4）血管内皮细胞 （5）淋巴细胞 （6）肌肉细胞 （7）肿瘤细胞 （8）其他细胞
矫正突变碱基，精确的原位修复 最理想，难以实现
(二)基因置换
指将特定的目的基因导入特定的细胞， 通过定位重组，以导入基因置换基因组 内的原有缺陷基因 基因打靶技术（同源重组）
（三）基因增补
1、概念 通过导入外源基因是靶细胞表达其本身不
表达的基因。 2、基因添加的两种类型 （1）针对特定的缺陷基因导入其相应正
常基因 （2）向靶细胞中导入靶细胞中本来不表
达的基因
（四）基因干预
采取特定的方式抑制某个基因的表达，或 通过破坏某个基因使之不表达
1.反义核酸技术 2.核酶 3.RNA干扰技术（RNAi)
三、基因治疗的基本程序
（一）目的基因的选择和制备
（二）靶细胞的选择
（三）基因的导入 （基因转移技术）
基因治疗的方式： 体内法：体内直接转移基因法
正常基因：设计寡核苷酸探针M GGTACGATGCGGTTAACGCG CCATGCTACGCCAATTGCGC
突变基因：设计寡核苷酸探针N GGTACGATGTGGTTAACGCG CCATGCTACACCAATTGCGC
MN
MN
MN
MN
杂交的结果：
（Ⅰ）受检者DNA与 N 杂交，与M不杂交：突 变基因纯合子
应用范围
1. 可快速准确查出致病病原体; 2.适于早期诊断、带菌带毒者和潜
在感染的发现； 3.大规模病原流行病学的现场筛查 4. 病原体抗药性的快速敏感试验; 5.对微生物的科属种进行准确分类
鉴定; 。
六 基因诊断在法 医学中的应用
PCR结合DNA指纹技术
Southern blot 应用
DNA指纹分析
第十六章
基因诊断与基因治疗 Gene diagnosis and gene therapy
基因诊断的概念：
以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法， 直接检查基因的结构、或表 达是否异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法。
用途——诊断下列两种类型疾 病：
1、内源基因的变异
2、外来生物的入侵
RT-PCR
C地中海贫血 珠蛋白基因3’端缺失0.6 kb
Bgl II
A C
Bgl II
（二）血友病A
factor VIII 基因缺陷（碱 基取代、缺失或插入等）
基因产物凝血因子VIII 无 活性或不稳定，导致凝血 障碍。
PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段
Bcl I 限制酶 酶切位点在 基因内18号外显子3´端
（Ⅱ）与M、N都能杂交：突变基因杂合子 （ Ⅲ）与M 杂交，与N不杂交：没有这种突变
基因 （Ⅳ）M、N均不杂交：可能是新突变
（2）诊断未知的点突变
常用检测方法：
①PCR-SSCP ②DNA芯片 ③测序
①PCR-SSCP检测法 单链构象多态性
Single strand conformation polymorphism SSCP
2、特点 （1）能够进行位点特异性整合 （2）无致病性 （3）载体结构简单 （4）稳定 （5）不引起肿瘤形成
（四）单纯疱疹病毒载体 1、结构
ab
U1
b`a`c`Us c a
2、特点 （1）滴度高 （2）容量大 （3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达
基因转移的非生物学方法 （一）脂质体 （二）直接注射法 （三）受体介导基因转移技术 （四）其他方法
dsDNA ssDNA
高温变性，快速冰浴
野生型DNA 突变型DNA
点样孔
慢
快 SSCP原理示意图
2、少数核苷酸缺失或插入突 变的诊断
方法同点突变的诊断
3、大片断缺失或插入突变的诊断 常采用PCR法
致病基因 引物1 引物3
引物4 引物2
4、基因重排（染色体易位）的 诊断
常采用PCR法
引物1 引物2
抑癌基因p53的检测
1、常见突变类型： 点突变突变热点在5~8号外显子，有少量插 入或缺失
2、常检测方法 （1）PCR-SSCP （2）PCR结合序列分析 （3）PCR-RFLP
五、感染性疾病的基因诊断
目前应用最多是PCR法，不仅可检测病 原体的DNA（如乙肝病毒、巨细胞病毒、 乳头瘤病毒、结核杆菌等），而且可检 测RNA病原体（RT-PCR检测艾滋病病 毒、丙肝病毒等）。
MstⅡ酶
A T替换 CCTNAGG
CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG------MstⅡ MstⅡMstⅡ 1.1kb 0.2kb
HbS ---------CCT GTG GAG-------
1.3kb
SS AS F AA
1.3kb 1.1kb 0.2kb
RFLP法检测HbS (放射性自显影图谱)
基本原理 单链DNA在中性溶液中可形 成一定的空间构象，构象与其碱 基顺序相关。因此当单链DNA中 碱基变异时，如碱基替换，它的 空间构象也发生一定变化。这种 现象称为单链构象多态性。
单链DNA在非变性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳时，其迁移率 不仅与链长有关，还与单链 DNA的空间构象有关，因此碱 基变异引起的构象变化也可改 变单链DNA的电泳迁移率。
其产物有详尽的了解，； （3）目的基因能在体外操作，能有效的导入靶细胞；能
在靶细胞中一段时间或长期稳定驻留； （4）导入基因能有适度表达； （5）基因导入方法和所用载体对靶细胞安全无害； （6）目的基因的表达不需严格控制，或能够人为控制； （7）人类的基因治疗需经过严格审批
二、基因治疗的主要策略
（一）基因修复或基因矫正
电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断
142 bp 99 bp
父
母 儿 胎儿 ( 先证者) (女)
四、 肿瘤的基因诊断
一)肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤标记基因或mRNA 2、检测肿瘤相关基因 3、检测肿瘤相关病毒基因
（二） 肿瘤相关基因的检测
ras癌基因的检测
1、常见突变类型： 点突变（突变热点在12、13、61位密码子的 编码区） 2、常用检测方法 （1）PCR-ASO （2）PCR-SSCP
2、特点 （1）宿主范围广 （ 2 ）腺病毒蛋白表达不以宿主 增殖为必要条件 （ 3 ）可获得高病毒效价 （ 4 ）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性 （7）无包膜，不易被补体灭活， 可直接在体内应用 （8）不整合入染色体
（三）腺相关病毒载体 1、结构
ITR
ψ
REP
ITR CAP
AA:正常 SS:HbS纯合子 AS:HbS杂合子 F:被检胎儿
（2）RFLP间接分析法—— RFLP连锁分析法
甲型血友病 疾病种类：X染色体连锁性 遗传病 缺陷基因：凝血因子Ⅷ基因
主要临床表现：出血性疾病
应用PCR-RFLP连锁分析法 诊断甲型血友病
用一对引物扩增凝血因子Ⅷ
基因第18外显子内的一个142bp片 断，该片断含一个BclⅠ多态性位 点。酶解后，如果存在BclⅠ酶切 位点，则产生99bp和43bp两个片 断；如果不存在则只有142bp一个 片断。研究证明，142bp片断与甲 型血友病基因连锁。
① 限制酶识别位点发生单
个碱基置换位片断， 即多态位点的有或无。
② 限制酶识别位点之间的 DNA序列缺失、插入或重组， 限制酶识别序列不发生变化， 但它在基因组中的位置发生 了变化。这种多态性可以有 两个或两个以上的等位片断。
RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。
二、基因诊断的内容和技术