多角度激光光散射联用仪

尺寸排阻色谱-多角度激光光散射联用仪（SEC-MALLS）
基本操作步骤
一、尺寸排阻色谱（Agilient1100高压液相色谱，示差检测器RID）
1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server 程序。

2、打开1100 LC 各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online 图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。

添加进样、高压泵、色谱柱、示差检测器各模块。

4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 调用已建立的方法“YJK”（多糖体系），或从“Method”菜单中选择“Edit entire method”项新建方法。

5、把流动相（如0.1M氯化钠）放入溶剂瓶中。

设置泵的流速0.5 mL/min，“Solvent B”处为100，其他均为0。

6、排完气后扭紧排气阀。

以0.2 mL/min的流速装预柱和色谱柱（Shodex系列，根据分子量不同选择合适的柱子803、805、806）。

7、以0.1 mL/min递增的趋势增加泵的流速到0.5 mL/min，单击示差检测器图标，进入Control选项，打开purge阀，平衡示差检测器600-800 min。

8、选择单进样方式进样，进样体积100 μL，进样位置为2号。

从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。

两者区别：Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。

Prefix—在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。

二、多角度激光光散射（DAWN HELEOS II，ASTRA V软件）
9、待示差检测器平衡好后，打开DAWN HELEOS II多角度激光光散射检测器，打开软件ASTRA V。

10、先在System的ISI和Istrument中确认仪器已经计算机连接上。

11、具体试验步骤File-------New------Experiment from Template--------System Template。

12、System Template，根据不同的试验进入不同的Template，如进入Laser Scattering-------Online (RI Consentration)。

点开所有前面带“+”的选项，由上到下注意设置。

右键单击DWAN HELEOS II-------Replace Configuration-------双击example configuration------双击Light scattering-------双击HELEOS II--------With Generic RI-------LS+RI ONLINE。

13、将Configuration、Procedures和Report中前面带“+”的全部点开。

Generic pump中将Flow rate根据前面设置的情况输入正确的数据；Solvent根据实际流动相选择。

点Name中最右边的按键，出现对话框，在System Solvent中选择合适的流动相，双击调入即可。

如没有给出这一溶剂，在Name中直接输入溶剂即可，Refractive Index Model中将Polynomial改为Fixed，Model Parameters 1中输入此种溶剂的折射率。

14、Injector中将Injector V olume设为正确的数值。

Sample中将Name输入样品名，dn/dc输入合适的数值，如0.1M氯化钠的dn/dc为0.125 mL/mg。

HELEOS II的主要是Physical Instrument和仪器常数：Physical Instrument的后面的按键点开，单击合适的仪器，Select。

15、在Calibration Constant中输入测好的仪器校正常数（3.2041×10-5 1/V.cm），RI的校正常数4.9732×10-4（氯化钠中测得常数），Rayleigh Ratio为3.6443×10-6
（11-15步骤中或者左键单击左侧Experiment，单击Open，调用多糖测定模板“yjk-standard”，修改个别参数后，另存为即可！！）
16、根据所选择的色谱柱设置Procedures中Basic Collection中的Duration 设采集时间（如Shodex SB-806色谱柱，Duration为60 min），点击下面的Apply。

17、Run，等待采集样品。

18、从Aglient液相色谱操作界面Method 菜单中选择“Run method”，进样。

19、设定的采集时间到后，软件自动停止采集或按STOP停止，然后保存数据。

在Aglient液相色谱操作界面中点STOP。

进入下一个样品的采集。

20、进样完毕后，按0.1 mL/min递减趋势调节泵的流速为0，换上0.2%的叠氮钠溶剂，以0.2 mL/min的流速运行3 h，拆掉色谱柱后，换上异丙醇作为流动相，以0.2 mL/min的流速运行3 h。

完毕后，关闭多角度激光光散射检测器，关闭液相色谱各模块电源，关闭电脑。

三、数据处理与分析
21、再按RUN，软件会出现对话框，大意为需要设定有关基线的参数。

然后在LS的11角的信号上设定基线，然后在下面的数据表的最后的Auto Baseline 后点击Auto Baseline，然后在图上检查各个角度和RI的基线设的是否合适，对不合适的进行修改。

然后点OK。

22、在左侧Procedures一栏的Peaks选项中，进行设定有关峰的参数。

在峰的起始位置一点，然后拖到峰的结束位置，这样峰就定好了。

23、Normalize在Experiment-------Configuration中Normalize。

在Peak number 中输入做归一化的样品的合适的峰的峰号，然后在Action中点击Normalize。

注意：Normalize归一化的校正一般使用分子量小于5万的样品来校正，此样品可以与要测的样品不是同一种类的物质，但必须要能溶于同一流动相中。

THE、Toluene等有机体系一般用PS标样，水相一般用BSA、Dextran、PEO等水溶性标样。

24、Alignment在Experiment-------Configuration中的Alignment，按住Ctrl 键用鼠标较所要Alignment的峰框起、放大，可以看出RI的信号在LS信号的后面。

用鼠标点中RI峰的峰尖处，将其拖到LS峰的峰尖处。

点击Take Delay From Graph中的Perform在Delay中就自动给出了延迟时间，并且峰尖也重合了。

（或者直接修改下面表格中的Delay (min)的数值，修改到两峰重合为止。

）
25、在Report中看结果，然后在File中Save as Template，把其存为一个Template。

四、注意事项
1、进行SEC-MALLS之前，一定要保证所测试样品有足够的纯度（>90%），以免影响测试结果。

（请特别注意）
1、仔细阅读仪器说明书或操作手册及其他随机文件，以期对仪器的性能、操作程序、维护保养等有充分的了解。

2、使用的纯水为屈臣氏蒸馏水（大润发、大统华均有售），配置好的流动相试剂必须要过滤膜（0.22μm）过滤，避免杂质进入色谱柱和分析仪器内。

尽量使用新配置的流动相，尤其是水作为流动相时。

（请特别注意）
3、在改变实验条件时，一定注意流动相之间的互溶性。

（请特别注意）
4、测试完毕，必须对仪器进行充分清洗，特别是盐水作为流动相时。

（请特别注意）
5、开机后，不论是单机实验还是联机实验，都要对仪器进行充分清洗平衡，建议平衡过夜。

五、清洁卫生
实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。

记录当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字。