多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术
GPC原理及应用
凝胶渗透色谱法GPC
（三）数据处理
2. 普适校准曲线
普适校准曲线首先 由 Benoit 于 1967 年 发 现并证明。普适校准曲 线显示对于一个非常宽 范围内的高分子结构， 当考虑了特性粘度的信 息后，其洗脱时间都遵 循普适校准曲线的描述。
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凝胶渗透色谱法GPC
（三）数据处理
3. 平均分子量 定义法
乙丙橡胶、丁苯橡胶、丁睛橡胶等。
凝胶渗透色谱法GPC
（二）仪器和实验技术 2.浓度检测器
示差折光和紫外吸收检测器是最常用。还有红外、电导和介电常数等。 示差折光检测器（RI）：利用溶液与溶剂之间折射率之差来测定浓度的。 优点是：通用性强，只要溶质与溶剂有折射率差别就可以应用。 紫外吸收检测器（UV）：有较强的选择性，它要求溶剂不能有紫外吸收， 比如四氢呋喃必须完全除掉阻聚剂2,6—二叔丁基对甲酚后才能使用。测定 时，波长常固定在一个单一值 （如254nm或280nm）。
凝胶渗透色谱法GPC
二、应用
（二）高分子的测定
3. 控制聚合反应终点
用GPC对聚合反应进行中间控制分析，在达到预定的单体／聚合物比后及 时终止反应，以节省生产时间。
凝胶渗透色谱法GPC
二、应用
（二）高分子的测定
4. 聚合反应过程的控制分析
GPC可用于跟踪缩聚过程，确定终止聚合的最佳时间。
聚：
凝胶渗透色谱法GPC
凝胶渗透色谱法GPC
（三）数据处理
如果GPC仪没有连接分子量检测器，则GPC谱图的横坐标不是分 子量，而是保留体积Ve（或时间），纵坐标是浓度检测器讯号H。
凝胶渗透色谱法GPC
（三）数据处理
1. 校准曲线 Ve与分子量M之间有如下线性关系：
多糖类高分子材料海藻酸钠的辐照降解
多糖类高分子材料海藻酸钠的辐照降解杨桂霞;李晓燕【摘要】对大分子量海藻酸钠进行了60Coγ辐照降解,并利用多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱仪联接系统(MALLS/GPC)测量了其辐照前后的绝对分子量变化.实验发现,当吸收剂量率为80Gy/min、吸收剂量为0～60kGy时,随吸收剂量的增大,海藻酸钠的分子量减小,重均分子量(Mw)从321596.5降至10024.同时,随着吸收剂量的增大,海藻酸钠分子量分布宽度变窄,积分分子重量占83.22％的单峰的Mw降为6000.分子量小于10000的海藻酸钠因具有优良的理化性质并能被人体很好吸收,在农业、医药和美容等领域有广泛的应用前景.通过对辐照后分子量分布曲线中出现的各峰值的计算,发现在辐照过程中除产生聚合度不等的海藻酸钠外,还产生了少量的新组分,这些新组分需进一步分离纯化,检测其生物毒性.【期刊名称】《原子能科学技术》【年(卷),期】2013(047)005【总页数】5页(P730-734)【关键词】60Coγ辐照;降解;多糖;分子量【作者】杨桂霞;李晓燕【作者单位】中国工程物理研究院核物理与化学研究所,四川绵阳621900;中国工程物理研究院核物理与化学研究所,四川绵阳621900【正文语种】中文【中图分类】O636.1;O644.2海藻酸钠是天然高分子材料海藻酸的钠盐，分子式为（C6H7O6Na）n。
人体无法吸收大分子量的海藻酸钠，但当海藻酸钠分子量降到一定范围后，易被人体吸收，可用于治疗高血脂症、冠心病及高血压症，并能用作代血浆，是维持血容量的良好扩容剂［1］，亦表现出优良的抗菌、吸湿、保湿等性能。
目前，低分子量海藻酸钠价格较昂贵，国内仅有少量使用，这与海藻酸钠广泛的用途和我国丰富的海藻酸钠资源是不相称的。
如能开发出实用、高效、环保的海藻酸钠降解方法将会带来可观的经济效益和社会效益。
现有工业化降解多糖类高分子材料工艺主要为酸催化降解法。
酸催化降解是利用多糖类高分子材料易与酸反应，苷键发生断裂，达到降解目的［2－3］。
光散射仪操作规程
18角度激光光散射仪凝胶色谱操作规程1、开机前准备：水：屈臣氏蒸馏水，有机溶剂：色谱纯。
缓冲盐溶液：配置完成后过2层0.22um滤膜。
流动相需准备充足。
2、系统平衡：根据需要选择凝胶柱以及需要连接的检测器。
开启脱气机，泵、柱温箱、检测器以及电脑开关。
点击quick start pump进行流速设置，点击ASTRA进行实验方法设置。
提前一天将流速调至试验所需流速进行系统平衡，其中注意流动相过渡问题，待检测器冲平后可进行进样分析。
3、进样：第一针建议标准样品归一化处理，用于激光18角度校正，建议进样前进行该处理。
多糖需用3-5mg/mL分子量为五万以下的右旋糖酐进行激光，蛋白质以2-4mg/mL的BSA作为归一化样品。
所以样品离心后取上层清液过0.45um滤膜。
手动进样器扳至load状态进行进样，一般需进3-5倍进样环体积以清洗进样环，点击软件中运行后将进样器扳至Inject状态进行数据采集。
4、数据分析：数据采集后需进行定基线、峰等数据处理，依据实验需要提前实验数据。
所有数据可以通过图表中邮件中edit进行数据导出。
5、关机：色谱柱和系统清洗-流动相冲洗2-3个小时，根据流动相性质选择合适溶剂过渡，如缓冲盐流动相冲洗后需用万分之二叠代钠清洗一晚上后换20%甲醇冲洗足够时间后，进行色谱柱保存，关闭仪器电源。
实验完成后做好登记工作。
6、注意事项：粘度检测器内部管理非常细，耐压性差，仪器开机后配有自动保护功能，故而使用粘度检测器时需先开机后启动泵。
进样后需用进样针清洗接头对进样器进行清洗。
仪器配置：1）18角度激光检测器：DAWN HELEOS 103 - 109 Da, 分子尺寸10-500nm ,激光波长：658nm ；2）粘度检测器：ViscoStar II 1-3mL/min；4 - 60℃温度可调；池体积：33 μL/ bridge arm 必须在线测试，连接GPC；3）RI检测器：Optilab rEX绝对折光指数范围（RIU）：1.2 - 1.8；4）柱温箱，脱气机等。
Wyatt多角度激光光散射凝胶色谱联用系统操作规程
Wyatt多角度激光光散射凝胶色谱联用系统操作规程（Wyatt GPC/SEC –MALS）一试验前准备1 溶剂准备水相体系准备：超纯水或配制其它盐溶液~ 1L，并使用0.22um滤膜过滤(必须含0.02%NaN3抑菌剂)。
有机相体系准备：HPLC级溶剂；建议使用0.22um滤膜过滤（进口试剂视具体情况而定）。
2 样品准备浓度配制（定量环100uL）：分子量~1000kda：0.5 - 1mg/mL；分子量~100kda：1 - 2mg/mL；分子量~10kda：3 - 5mg/mL；分子量~5kda：5 - 10mg/mL。
3 检查仪器电路连接检查仪器电源线是否连接，电源开关、交换机（适用于信号连接通过网线的情形）是否打开。
二仪器系统开机及平衡操作1 分别依次打开泵、柱温箱(设定温度)、进样系统（手动/自动进样器）、示差或紫外检测器、粘度检测器、多角度激光光散射检测器电源及计算机。
待仪器正常开机后，打开工作站Astra软件。
2 开启泵，使用超纯水purge泵~5min；关闭purge阀。
冲洗系统。
待系统平衡完毕，使用最新配制的流动相冲洗系统。
（注：有机体系：直接使用流动相冲洗系统）3 将其流速调至0.1mL/min（若接入粘度检测器，必须待粘度检测器进入工作界面才能开启泵的流速，且IP &DP 处于purge on）；若系统中未接入GPC/SEC柱，可直接将流速调至0.1 – 1.0mL/min冲洗系统（无粘度检测器），示差检测器purge阀必须处于“Purge On”状态。
若系统中已接入GPC/SEC柱，则必须以0.1ml/min的起始流速，每1－2分钟提高0.1ml的速度，将流速调整至0.4 – 0.5 mL/min，充分平衡系统；（注：为了使系统充分平衡，建议提前一天冲洗和平衡系统；第二天开始试验（水相系统）。
对于有机相体系，一般平衡时间在3 －12h）。
三试验操作及数据采集与处理1 待系统充分平衡。
G P C 一 十八角激光光散射介绍
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图中纵坐标相当于淋洗液的浓度， 图中纵坐标相当于淋洗液的浓度，横坐标淋出体积Ve 表征着高 分子尺寸的大小。 分子尺寸的大小。 如果把图中的横坐标Ve转换成分子量M 就成了分子量分布曲 要借助GPC校正曲线。 GPC校正曲线 线。为了将Ve转换成M，要借助GPC校正曲线。实验证明在多孔填料 有如下关系： 的渗透极限范围内Ve.1 示差折光检测器
示差折光检测器是一种高度稳定和灵敏的液相色谱和 示差折光检测器是一种高度稳定和灵敏的液相色谱和 液相色谱 凝胶渗透色谱检测器，它可与输液泵，色谱柱， 凝胶渗透色谱检测器，它可与输液泵，色谱柱，进样器等组成凝胶 检测器 渗透色谱仪或高速液相色谱仪系统， 渗透色谱仪或高速液相色谱仪系统，也可以配置适当的进样系统作 为单独的分析仪器使用。可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的 为单独的分析仪器使用。可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的 紫外光范围内吸光度不高 化合物， 聚合物、 有机酸和甘油三酸酯。 化合物，如聚合物、糖、有机酸和甘油三酸酯。示差折光检测器的 偏转式设计，能够对那些具有低噪音和位移特性的化合物进行灵敏 偏转式设计，能够对那些具有低噪音和位移特性的化合物进行灵敏 低噪音和位移特性
G P C 一 十八角激光光散射联用法介绍
一、基本介绍
GPC（Gel Permeation Chromatography ） ,凝胶渗透色 （ 凝胶渗透色 谱，又称为尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography,简 又称为尺寸排阻色谱（ 简 ），它是基于体积排阻的分离机理 称SEC），它是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的 ），它是基于体积排阻的分离机理， 固定相，用来分离相对分子质量较小的物质， 固定相，用来分离相对分子质量较小的物质，并且还可以分析分子 相对分子质量较小的物质 体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。 体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。
《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》标准中质量控制方法的研究进展
•综述•《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》标准中质量控制方法的研究进展于 浩1,2 姜爱莉1 李 敏1,2 付步芳2 综述，王召旭2审校（1.烟台大学 山东 烟台 264000；2.中国食品药品检定研究院 北京 102629）[摘要]透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是人体组织成分之一，广泛存在于人体皮肤、软骨组织、韧带以及眼睛玻璃体中，具有良好的生物相容性、亲水性、粘弹性及低免疫原性。
生物工程生产的交联透明质酸钠凝胶具有相似的生物学特性，是目前最常用的注射微整手术填充材料之一。
该文首先回顾了注射整形行业的发展历史，同时分析了交联透明质酸钠凝胶在整形行业的应用，包括面部除皱、隆鼻颏、瘢痕修复等部分，重点阐述了整形手术用交联透明质酸钠凝胶质量控制的方法，包括交联剂残留量、透明质酸钠含量、溶胀度、蛋白质含量、重金属含量以及分子量等。
结合国内外交联透明质酸钠凝胶的研究动态，提出了今后的发展前景。
[关键词]透明质酸；交联透明质酸钠凝胶；注射整形；质量控制[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）12-0185-05Research Progress of Quality Control Methods in the Standard of Cross-linkedSodium Hyaluronate Gel for Plastic SurgeryYU Hao 1,2,JIANG Ai-li 1,LI Min 1,2,FU Bu-fang 2,WANG Zhao-xu 2(1.Yantai University, Yantai 264000,Shandong,China;2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629,China)Abstract:Hyaluronic acid (HA) is one of the components of human tissues. It is widely present in human skin, cartilage tissues, ligaments, and vitreous eyes.It has good biocompatibility,hydrophilicity, viscoelasticity,and low immunogenicity.The cross-linked sodium hyaluronate gel produced by bioengineering has similar biological characteristics and is currently one of the most commonly used filling materials for injection microsurgery.This article first reviews the development history of the injection plastic surgery industry,and analyzes the application of cross-linked sodium hyaluronate gel in the plastic surgery industry, including facial wrinkle removal, rhinoplasty, scar repair and other parts, focusing on the use of plastic surgery The method of quality control of sodium hyaluronate gel includes the residual amount of crosslinking agent, sodium hyaluronate content, swelling degree, protein content, heavy metal content and molecular weight. Combining the research development of cross-linked sodium hyaluronate gel at home and abroad, the future development prospects are proposed.Key words:hyaluronic acid;cross-linked sodium hyaluronate gel; injection shaping; quality control基金项目：国家重点研发计划（编号：2017YFC1105000）通信作者：付步芳，主任药师，研究生导师；研究方向：生物材料和医疗器械的质量控制；E-mail：**************王召旭，研究员、博士、研究生导师；研究方向：医疗器械生物安全性评价；E-mail：****************.cn 第一作者：于浩，硕士；E-mail：*****************并列第一作者：姜爱莉，教授、博士；研究方向：海洋生物化工；E-mail：***************透明质酸（Hyaluronic acid,HA）是由双糖单位重复排列而成的线性高分子直链多糖聚合物，是细胞外基质的重要成分，其分子量可达107Da [1]。
第九章凝胶渗透色谱讲解
第九章凝胶渗透⾊谱讲解凝胶⾊谱分析⼆〇⼀⼀年九⽉九⽇第九章凝胶⾊谱分析凝胶渗透⾊谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），⼜称尺⼨排阻⾊谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）⽽实现物质的分离。
GPC可⽤于⼩分⼦物质和化学性质相同⽽分⼦体积不同的⾼分⼦同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透⾊谱是测定⾼分⼦材料分⼦量及其分布的最常⽤、快速和有效的⽅法[1]。
凝胶渗透⾊谱（GPC）的创⽴历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman⽤多孔离⼦交换树脂按分⼦量⼤⼩分离了苷、多元醇和其它⾮离⼦物质，观察到分⼦尺⼨排除现象；1959年Porath和Flodin⽤葡聚糖交联制成凝胶来分离⽔溶液中不同分⼦量的样品；1964年J. C. Moore将⾼交联密度聚苯⼄烯-⼆⼄烯基苯树脂⽤作柱填料，以连续式⾼灵敏度的⽰差折光仪，并以体积计量⽅式作图，制成了快速且⾃动化的⾼聚物分⼦量及分⼦量分布的测定仪，从⽽创⽴了液相⾊谱中的凝胶渗透⾊谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所⽰，⼀束光通过⼀间充满烟雾的房间，会产⽣光散射现象。
）⼴泛应⽤于⾼分⼦特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透⾊谱（GPC）分离技术相结合，可以测定⼤分⼦绝对分⼦量、分⼦旋转半径、第⼆维⾥系数，也可测定分⼦量分布、分⼦形状、分枝率和聚集态等。
⽬前，该技术在⾼分⼦分析领域已成为⼀种⾮常有效的⼯具，在美国，⽇本及欧洲⼴为使⽤，国内近年来亦引进了此项技术。
⼊射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透⾊谱分离原理让被测量的⾼聚物溶液通过⼀根内装不同孔径的⾊谱柱，柱中可供分⼦通⾏的路径包括粒⼦间的间隙（较⼤）和粒⼦内的通孔（较⼩）。
如图9-2、图9-3所⽰，当待测聚合物溶液流经⾊谱柱时，较⼤的分⼦只能从粒⼦间的间隙通过，被排除在粒⼦的⼩孔之外，速率较快；较⼩的分⼦能够进⼊粒⼦中的⼩孔，通过的速率慢得多。
凝胶色谱法
分离原理
自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的 淋出液总体积称为该试样的淋出体积。
当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出 体积与其分子量有关，分子量愈大，其 淋出体积愈小。
实验部分
直接法：在测定淋出液浓度的同时测定 其粘度或光散射，从而求出其分子量。
间接法：用一组分子量不等的、单分散 的试样为标准样品，分别测定它们的淋 出体积和分子量，则可确定二者之间的 关系。
凝胶渗透色谱法
Gel Permeation Chromatography (GPC)
基本原理 实验部分 演示实验
基本原理
➢ 1964年，由J.C.Moore首先研究成功。
➢ 不仅可用于小分子物质的分离和鉴定， 而且可以用来分析化学性质相同分子体 积不同的高分子同系物。(聚合物在分离 柱上按分子流体力学体积大小被分离开）
基本原理
校正原理
聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并 不多，没有标准样的聚合物就不可能有校正曲 线，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相对 分子质量和相对分子质量分布。对于这种可以 使用普适校正原理。
普适校正原理
由于GPC对聚合物的分离是基于分子流体力学体 积，即对于相同的分子流体力学链的流体力学体积相同：
填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的 要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶 （适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯 凝胶（最高100℃，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂） 多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔 氧化铝（适用于水和有机溶剂） 柱子：玻璃、不锈钢
检测系统：
实验部分
溶剂的选择：
✓ 能溶解多种聚合物 ✓ 不能腐蚀仪器部件 ✓ 与检测器相匹配
实验部分
色谱柱对于多分散聚合物的分离作用是 基于体积排除机理，与分子量没有直接 联系。
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多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术
仪器组成：
Wyatt DAWN HELEOS Ⅱ（十八角度激光光散射检测器）
Wyatt ViscoStar Ⅱ(粘度检测器)
Wyatt Optilab rEX （示差折光检测器）
配一套Waters 515单元泵和柱温箱。
检测原理：
光散射法是测定高分子物质重均分子量的绝对方法。
高分子溶液可视为不均匀介质，当光通过它时，入射光的电磁波诱导高分子成为振荡偶极子，并产生强迫振动作为二次光源发出散射光。
高分子溶液的散射光强度远远高于其溶剂，并且强烈依赖于高分子的分子量、链形态、溶液浓度、散射光角度和折光指数增量（dn/dc值）等基本参数，从而得到高分子物质的绝对分子量。
凝胶渗透色谱可将溶剂中的高分子物质按照分子量的大小依次洗脱出来。
利用光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术，除了可以得到物质的平均分子量，还可以测得不同的高分子物质的分布及其相应分子量大小，并且不需要使用结构相似的标准样品做标准曲线。
在直接测定
高分子物质的绝对分子量的同时，由于联用了粘度检测器和示差折光检测器，还可得到特性粘数、均方根旋转半径等重要参数。
应用：
光散射强度与分子大小直接相关，凝胶渗透色谱能分离不同分子量大小的高分子物质，结合次两种特性，可得到许多重要信息，已经被广泛应用于高分子化学、生物化学等众多研究领域。
第一，高分子物质的分子量的测定。
不需要标准品、校正曲线以及任何假设，即可直接求得高聚物、多糖、蛋白质等多种高分子物质的绝对分子量。
测定范围广泛，可达103～107，且采用十八角度激光光散射检测器，准确度高。
第二，多组分高分子物质的平均分子量及其相应组分对应的绝对分子量的测定。
不仅可以单机操作测定混合物质的平均分子量，还可结合凝胶渗透色谱分离技术，测定各个分子量不同的各个不同组分的绝对分子量。
第三，高分子物质的折光指数增量（dn/dc值）、均方根旋转半径（Rg）、第二维里系数（A2）等重要参数和重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）等多种不同分子量的测定，可得到分子的分枝程度等形态特征，研究高分子物质与溶剂的相互作用，研究高分子物质的聚合与降解作用等。
具体检测工作：
第一，化学品、药品的合成过程中的质量控制，通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定药品的含量品质。
例如，以某一高聚物为母体，在其上进行聚合反应，通过分子量的测定，控制反应的进行程度。
第二，食品生产过程中的质量控制。
通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定食品的品质。
例如，在高蛋白牛奶中的蛋白质的分子量，当蛋白质过大时是不利于人体吸收的，通过测定其分子量，对食品的品质进行鉴定。
第三，医疗器材材料的降解聚合作用的研究。
例如，聚乳酸被广泛应用于心血管支架、假牙的医学材料中，在医疗器材申报的过程中要求对其降解作用进行研究。
标准：
1、GB/T 21864-2008 聚苯乙烯的平均分子量和分子量分布的检测标准方法高效体积排
阻色谱法
2、GB/T 21863-2008 凝胶渗透色谱法(GPC) 用四氢呋喃做淋洗液
3、SH/T 1759-2007 用凝胶渗透色谱法测定溶液聚合物分子量分布。