RT-PCR详细图文解析
RT-PCR详细图文解析
一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达ppt课件
1 234
cDNA
假阳性对照（出现的PCR扩增 条带一致，有时更整齐更明亮）
假阴性对照（什么条带没有）
汇报人：李尽美ຫໍສະໝຸດ 日期：2016-11-21
37
反转录可用的引物
随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子
0
全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋
1
予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来 源于rRNA。
Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因
03 绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾， 此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
cDNA
PCR
基因表达水平
7
Ques
8
反转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖 RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； (2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； (3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA.
查找P53序列
引物设计的原则
引物应用核酸系列保守区内设计 并具有特异性
1
产物不能形成二级结构
2
引物长度一般在15~30碱基之间
3
G+C含量在40%~60%之间
4
5 碱基要随机分布
6
引物自身及之间不能有连续4个碱 基的互补
7
引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰
8
引物3′端要避开密码子的第3位
Ques
特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为
RTPCR(共47张PPT)
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
上机操作
点击
运行程序
保存
结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
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实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，
RTPCR实验报告课件
逆转录pcrrt-pcr）和及时为反转录rcr （ reverse transcription pcrpcr （ real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr ，或许称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反响 (pcr) 中，一条 rna 链被逆转录成为互补 dna ，再以此为模板经过的一种宽泛应用的变形。
在pcr 进行dna 扩增。
rt-pcr由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录” ，由依靠rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来达成。
随后，dna 的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠rna 的dna 聚合酶达成，随每个循环倍增，即往常的pcr 。
原来的rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术，于遗传病的诊疗，并且能够用于定量监测某种rna 模板被rna 酶 h 降解，留下互补dna 。
能够检测很低拷贝数的rna 。
rt-pcr宽泛应用rna的含量。
（检测基因表达的方法，拜见northern blot 法。
）rt-pcr 作“ 定量有时也会指代及时pcr ” (quantitative pcr)pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录或许rtq-pcr(real-time quantitative pcr)pcr 相差别，往常被写。
及时pcr及时为基础进行pcr(real-time pcr)dna 的定量剖析。
，属于定量pcrreal time pcr（ q-pcr）的一种，以一准时间内dna 的增幅量的定量使用萤光色素，当前有二种方法。
一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相联合的一种萤光探针（probe ）。
real time pcr 与reverse transcription pcr 相联合，能用微量的rna 来找出特准时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
RT-PCR及其产物电泳分析ppt课件
RT mix的成分：RNasin、5×RT反应缓冲液、2.5mM dNTPs、Oligo(dT)16、逆转
录酶(MMLV)
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;.
实验步骤
（4）标记一个洁净的200μL反应管，向其中依次加入：
ddH2O 2×PCR mix
Primer mix cDNA模板
6 μL 10 μL 2 μL 2 μL
20 μL （5）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。
泳道2：靶DNA扩增； 泳道3：阴性对照
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RT-PCR检测人β-actin基因表达（扩增产物长度
260 bp）
;.
问题及解决方法
➢ 无PCR产物
1. 确保mRNA无降解。 2. 确保酶未失活。 3. 确保引物无降解。 4. 重新设置退火温度。 5. 重新设置变性温度。
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;.
问题及解决方法 ➢ PCR产物呈拖尾现象
1. 提高退火温度。 2. 减少Taq DNA聚合酶的用量。 3. 试用二步法进行PCR扩增。 4.调节Mg2+浓度，使之最优化。Taq DNA聚合酶发挥活性需要Mg2+参与，通过Mg2+介导与模板
DNA、引物及dNTP结合。通常Mg2+浓度为0.5～2.5mM，Mg2+浓度过高，将引起非特异扩 增产物增多；反之，Mg2+浓度过低则导致产量降低。 5. 减少延伸时间。 6. 减少循环次数。 7. 设计新的引物。 8.采用热启动法进行PCR。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
10 PCR mix的成分：PCR反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、Taq DNA聚合酶
;.
实验步骤 （6）在PCR仪上设置反应循环参数:
本次实验为：94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环数为26，最后于72 ℃充分延伸5 min 后，终止反应。 （7）置反应管于PCR仪上进行热循环。 （8）反应完毕后，取5 μLPCR产物，于1.5 ％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
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RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
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RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
《RTPCR技术原理》课件
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
定量RT-PCR原理 PPT课件
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
5’
未知样品 标准品：产生标准曲线
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
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一、实时荧光定量PCR原理
（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理
1、常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
3、如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
CT值的重现性：
5、定量原理：
理想的PCR反应：X=X0*2n
非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
5、标准曲线
6、绝对定量
1）确定未知样品的C(t)值
2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记：
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一：SYBR Green法
（一）工作原理
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:
1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4、反应Buffer 体系的优化
5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6、其他与常规PCR相同
（二）应用范围
1、起始模板的测定；
2、基因型的分析；
3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
（三）优点及缺点
优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。
缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
方法二：TaqMan---水解型杂交探针
**5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)
** 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
（一）工作原理
注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S
60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）
也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值
引物浓度：50-900nM
探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同
（二）优缺点
优点：
对目标序列的高特异性
------阴性结果确定
设计相对简单
------与目标序列某一区域互补重复性比较好
缺点：
只适合一个特定的目标;
委托公司标记，价格较高;
不易找到本底低的探针。