NEB T4DNA连接酶
T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能
T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能贺添艳;刘亚娟;徐文选;刘猛;刘亮伟【摘要】T4 DNA连接酶（T4Lig）在基因工程中有重要作用，科研人员对该工具酶性质了解不全面易导致平端DNA连接效率很低、甚至失败。
所以对T4Lig性质功能的全面认识有助于基因重组，特别是平端DNA连接中的应用。
为了提高平端DNA连接效率，以及进一步阐明平端连接机理，本文综述了T4Lig酶分子大小、保真性、切口DNA连接机理、平端DNA连接端口检测、酶分子性质理性改造等研究进展，并对平端连接中有待解决的几个问题进行了展望。
%T4 DNAligase(T4Lig)is important in gene recombination. Because of wide usage and being provided by company,its property is not thoroughly understood,which leads to low efficiency,sometimes even failure,in blunt-end DNA ligation. In order to recombine gene efficiently in blunt end DNA ligation and to further elucidate ligation mechanism of blunt-end DNA,the paper summarized such properties as enzyme size,fidelity,ligation mechanism of nick DNA,assay methods of nick-sealing,and rational engineering of enzyme properties. Some unsolved problems in blunt end DNA ligation were also provided. Therefore,to understand thoroughlyT4Lig properties is useful for genetic recombination in vitro.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2016(034)007【总页数】5页(P1058-1062)【关键词】T4 DNA连接酶;性质;功能;平端连接【作者】贺添艳;刘亚娟;徐文选;刘猛;刘亮伟【作者单位】河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002; 农业部农业酶工程重点实验室，郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q556DNA连接酶（EC 6.5.1.1）用于体外DNA连接、连接检测PCR，体内冈崎片断连接成完整基因组DNA有重要作用.基因工程所用DNA连接酶由公司提供，最常用的是T4 DNA连接酶（T4Lig）.因为应用广泛并由公司提供，较多科研人员常忽略对其性质的全面了解，导致体外平端DNA连接效率很低，转化中出现很多问题.为克服平端连接效率低的问题，常常需要引入限制性酶切位点，而后通过限制性内切酶切割，将平端DNA转换为粘性末端进行DNA连接，此时受到限制性酶切效率的限制，从而影响科研进程.所以，对T4Lig性质的全面了解迫切必要. DNA连接酶有两类，一类以NAD为辅基，主要来源于细菌，代表是E.coli连接酶，常规反应条件下能连接切口（nick）、粘性（cohensive）末端双链DNA ［1］.另一类以ATP为辅基，来源于病毒、噬菌体、真核生物DNA，代表是T4Lig，能连接切口、粘性末端双链DNA，常规反应条件下能够连接平端（blunt）DNA.T4Lig由T4嗜菌体30基因合成，最早从T4嗜菌体感染的E.coli提取.后来发现DNA复制缺失型嗜菌体中连接酶产量更高，从而作为连接酶的主要来源，目前市场供应连接酶通过基因工程方法生产［2］.Murry测定T4Lig分子量为63 000～68 000 Da［2］，Armstrong进一步确定为55，230 Da，由487个氨基酸（Aa）残基组成，基因长度1464 bp（GenBank序列号为X00039）［3］.按照分子量与分子大小比例关系估算，T4Lig大小约3.4 nm，可跨越约1个DNA双螺旋长度（即10 bp）［4］.连接酶占据连接端口下游（5'-P端部）7～10 bp，占据端口上游（3'-OH端部）3～5 bp［5］.只有487Aa的酶分子同时具有连接活性，拓扑异构活性表明其结构、功能比较复杂.与之相比，E.coli DNA连接酶671Aa，分子量74 000 Da，每个E.coli细胞含有约300个DNA连接酶分子［6］，与DNA聚合酶分子个数接近［7］，可以满足DNA复制时冈崎片断连接需要［3］，细菌和真核生物中冈崎片断长度分别为1000 bp左右和100～200 bp.相对于DNA聚合酶，连接酶保真性不太熟悉，特别是DNA体外连接的科研人员.连接酶保真性是指酶分子识别连接端口核苷酸的能力.T4Lig识别连接端口碱基能力较低［8］，从而连接多种异常端口：3'或5'无嘌呤或无嘧啶碱基、缺失1 nt的连接端口、3'和5'A-A或T-T配对、5'G-T配对、3'C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配对.连接反应中加入亚精胺（spermidine）、高盐缓冲液，或降低连接酶用量可以提高T4Lig保真性［9］.Wu等发现100 nM DNA在1 UT4Lig，200 mM高盐浓度下保真性可提高60倍.随着保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低～30倍［10］.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA连接酶保真性较高，可识别1 nt缺失端口和3'A-G或T-G配对端口，但是识别5'A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高.5'-P端部核苷酸识别能力较低可能与5'-P-AMP复合物的形成有关.与常温作用的T4Lig连接酶（37℃）不同，有些高温作用的DNA连接酶：Pyrococcus furiosus（Pfu）连接酶、Thermus aquaticus（Taq）连接酶、Thermus thermophilus（Tth）连接酶［11］、Thermotoga maritima（Tma）连接酶［12］. Taq DNA连接酶反应温度45～65℃，Tma DNA连接酶反应温度60℃.Taq DNA连接酶保真性比T4Lig、E.coli DNA连接酶高很多［13］.Tth DNA连接酶保真性比T4Lig高24倍.Tth DNA连接酶具有3'-5'外切活性，可以切去与模板非匹配碱基［8］.Tth DNA连接酶的保真性较高，可能与Tth DNA聚合酶3'-5'外切活性较低有关，高温菌T.thermophilus DNA合成中很少掺入错配碱基，需要Tth DNA连接酶切去冈崎片断连接时错配碱基.Tth DNA连接酶中K294R和K294P突变后，既保留了该酶的切口DNA连接活性，又提高了保真性约4倍和11倍［8］.T4Lig识别错配碱基能力较低，可能与T4 DNA聚合酶的3'-5'外切活性有关.目前DNA连接反应机理是基于切口双链DNA底物得到的［9］：普遍认为连接反应由三步完成：①T4Lig先由ATP供能产生E-AMP复合物；②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5'-P基团，形成5'-P-AMP复合物；③3'-OH亲核攻击5'-P-AMP形成磷酸二酯键，并释放出AMP.在PDB数据库（October 2015 Release）检测不到T4Lig的晶体结构，导致连接机理不完全明了，特别是平端DNA连接机理不完善.以热稳定性Pfu DNA连接酶晶体结构为模板，笔者通过同源分子建模模拟T4Lig结构（图1）.显示出DNA 连接酶有三个保守性结构域：DNA结合结构域DBD（DNA-binding domain，M1～L129），腺苷酰化结构域AdD（adenylaition domain，I130～E368），寡核苷酸链结合结构域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369～E482）.腺苷酰化结构域AdD中K159是腺苷酰化位点，通过该位点形成N6-AMP-lysine酶-底物复合物.根据相似性比对发现，R164、R182、R359、K365是ATP 结合位点，E217、E344二价金属离子结合位点（UniProtKB登录号：P00970）. Rossi等切除T4Lig N-端80个Aa、C-端57个Aa、C-端137个Aa分别得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突变体，酶学性质表明N端80个Aa、C端57个Aa在DNA结合中起重要作用［14］.模拟结构显示N端M1～L129是DBD结构域，C端V369～E482是OBD结构域（图1），均与DNA结合有关.端部切除显示E-DNA复合物有两种状态：腺苷酰化酶分子复合物的短暂态（T·complex）：是指ATP将AMP转移到连接酶K159上形成E-AMP复合物；去腺苷酰化态酶分子复合物的稳定态（S·complex）：是指E-AMP复合物将AMP转移到连接端口5'-P 基团形成5'-P-AMP复合物，需要寻找附近的3-OH，所以此时E-DNA复合物是一种稳定态，稳定态复合物与平端连接有关.K159是T4Lig酶分子腺苷酰化作用位点，K159L突变体表明K159不参与识别DNA、但是K159L突变后酶分子不能完成自身腺苷酰化.在AMP存在下，K159L突变体具有DNA内切活性，可以将超螺旋质粒DNA切成环状切口DNA，解除DNA超螺旋.Sgaramella检测到T4Lig具有平端连接功能［15］.T4Lig以切口双链DNA为底物时动力学参数显示Kcat= 0.4 s-1，Kcat/Km=1.5×108M-1s-1［16］，以粘性末端、平端DNA为底物时Km值分别为0.6 μM、50 μM，表明T4Lig对切口比平端端口DNA亲合力高5个数量级，所以平端DNA连接时需要高出10倍的酶量.在T4 RNA连接酶存在时，T4Lig连接平端DNA效率接近于粘性末端DNA.T4Lig连接平端DNA效率很低，加入高浓度血清白蛋白、聚乙二醇（PEG：polyethylene glycol）、Ficoll0、高氯化钴能提高平端连接效率［11，16］.PEG 存在时，大鼠肝细胞核连接酶和E.coli连接酶也能连接平端DNA，笔者发现加入32%PEG200后E.coli连接酶具有平端连接功能.PEG存在时，提高温度有利于分子连接.粘性末端需要碱基间互补匹配的氢键作用，16℃过夜连接更有效.平末端不需要氢键作用，在20℃较高温度下容易形成磷酸二酯键.DNA浓度高于0.3 nM容易形成分子间连接、主要用于基因克隆.DNA浓度低于0.3 nM时容易形成分子内连接，主要用于质粒DNA分子自身环化，DNA分子内平端连接可以高效构建重组质粒［17］.目前分子内连接主要用于突变研究，如Quickchange、TaKaRa MutanBEST Kit突变、原位易错PCR一步构建突变体文库等.因为平端连接效率很低，为了将平端转换为粘性末端，在DNA端部引入限制性酶切位点，通过酶切后产生粘性匹配末端以提高连接效率.为了避免限制性酶切效率的限制，通过T载体、PEASY-载体、拓扑异构酶连接载体等粘性连接载体，进一步，开发了无限制性酶切的PCR方法连接载体［17］，利用噬菌体同源重组酶的同源基因克隆方式，Gibson连接方式是利用T5外切酶产生粘性匹配末端，由Phusion DNA聚合酶将缺口补齐，而后由Taq DNA连接酶连接端口.DNA连接需要三个步骤完成，ATP将AMP转移到酶分子K159上，而后E-AMP 复合物识别DNA双链切口位置，将AMP转移到端口5'-P形成5'-P-AMP复合物，在酶分子作用下由3-OH亲核攻击形成磷酸二酯键.通过下列几种方式检测连接端口是否形成二酯键.1）限制性内切酶检测：经限制性酶切的质粒DNA经T4Lig连接后，能够用相同的限制性酶切开，说明T4Lig将平端DNA连接成双链.2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）抗性检测：碱性磷酸酶能够从线性DNA端部降解核苷酸，酶连产物如果能抗碱性磷酸酶消化，则表明单个DNA分子连接成多聚物［1，17］.电泳可以检测DNA单体是否形成了多聚体，但是只能检测是否存在多聚体，不能证明是否形成磷酸二酯键.3）碱变性检测：经高温变性或碱变性后，重新恢复到非变性环境，不同构型的DNA分子有不同表型.环状DNA能保持环状形态，但是线性（或环状切口）DNA 则会在碱变性后成为“bushes”［18］.笔者电泳检测发现碱变性后线性DNA分子还是处于变性前的条带位置，可能分子量相同而构型不同.4）DNA环化后转化率检测：完整质粒经化学方法转化可产生104个转化子/ng，检测DNA环化后能否达到此种转化率，从而证明DNA连接后是否形成完整质粒.电泳能够检测DNA连接产物是否产生超螺旋条带，但是必须≥10 ng才能检测出来.不同限制性酶切出的平端连接效率不同，Rusche发现Bsu限制性酶切割SPPI/pSC101 DNA产生的DNA在15～25℃连接效率大约达到75%.但是连接产物转化后，只达到＜4%质粒转化率［16］，说明质粒DNA经酶切后再连接不能形成完整质粒.笔者发现平端DNA连接后转化率约为4%，表明DNA连接形成质粒的效率不高.在超螺旋质粒DNA中加入T4Lig，会发生RF1和RF2构型的转换，4 h后有5%质粒DNA是RF1构型，由T4Lig拓扑异构活性产生.硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）双链DNA结合蛋白Sso7d具有底物结合活性，将其融合Pfu DNA聚合酶，保留了DNA扩增的保真性，同时提高了聚合酶3'-5'外切活性，从而切去与模板非匹配碱基，提高了聚合酶持续合成能力［19］.高保真的Phusion、Q5 DNA聚合酶同样融合了DNA结合结构域，从而提高了聚合酶持续合成能力.因为T4Lig对平端DNA连接效率很低，其理性改造是融合DNA结合结构域.Wilson等为了提高T4Lig连接酶对底物结合力，进行了Sso7d与连接酶的融合研究.融合Sso7d后，T4Lig对平端DNA连接活性提高了60%.融合人工合成的家鼠-人类嵌合型转录因子cTF后，T4Lig对平端DNA和载体连接效率提高160%.融合人类转录因子NF-kB p50-后，E.coli DNA连接酶的连接效率也得到明显提高［20］.虽然T4Lig有了深入研究，但是DNA连接中还存在很多问题，主要是平端连接问题，具体分析如下.1）平端DNA连接机理不明确：目前DNA连接机理是基于切口双链DNA底物得到的，所以，对平端DNA的连接机理认识还不完善，主要体现在平末端DNA连接效率不高.平端连接与粘性末端连接有多少相同之处？什么原因导致平端连接效率不高？如何提高平端连接效率？PEG等高分子提高平端连接效率的真正机理是什么？2）T4Lig结构的测定：目前PDB库中还没有T4Lig的晶体结构数据，特别是E-DNA复合物结构更利于阐明平端连接机理.人类连接酶-切口DNA结构测定（PDB：1CKM）表明连接酶能够重新调整端口处6 bp区域的双螺旋构型，将连接端口上游的DNA转换为A构型，连接端口下游DNA保持B构型状态，暴露出连接端口核苷酸从而便于形成磷酸二酯键［4］.对于平末端DNA来说，双链均为连接端口、均为5'-P，则端部暴露出的核苷酸更多，也就是连接端口上、下游均转换为A型DNA.3）连接端口核苷酸缺失或插入：笔者开发的分子内连接能够高效构建重组质粒［17］，有时发现端口连接处核苷酸缺失或插入.因为T4Lig平端连接效率不高，前人也发现克隆失败.这种核苷酸缺失或插入是否由T4Lig造成？保真性高的高温连接酶可以切去错配碱基，T4Lig是否具有这种活性？T4Lig对不同限制性酶切出的平端端口连接效率不同［16］，是否表明连接端口核苷酸对连接效率有影响？4）DNA双螺旋结构对连接效率的影响：一个DNA双螺旋由10 bp核苷酸组成，完整螺旋间端口容易连接，非完整螺旋DNA端口如何连接？一个双螺旋直径为2 nm，平端连接时，一条链的5'-P是否影响到另一链的二酯键形成？平端端口距离是否能够形成磷酸二酯键？上述所有问题均归因于DNA连接机理认识不完善，这些问题有待进一步阐明.虽然T4Lig作为DNA连接的工具酶使用了近60年，但是因为由公司提供、同时又是广泛使用，科研人员对其性质了解还不全面，特别是平端DNA连接机理.本文通过综述T4Lig的酶分子大小、保真性、切口DNA连接机理、连接端口检测、酶分子性质理性改造等方面的研究进展，全面了解它的性质、结构、功能，以期达到快速高效体外DNA连接，同时总结了几个有待解决的问题，以期对T4Lig有更深入、更全面的研究理论.【相关文献】［1］Sgaramella V.Enzymatic oligomerization of bacteriophage P22 DNA and of linear simian virus 40 DNA［J］.Proc Natl Acad Sci，1972，69：3389-3393.［2］Murray N E，Bruce S A，Murray K.Molecular cloning of the DNA ligase gene from bacteriophage T4.II.Amplification and preparation of the gene product［J］.J Mol Biol，1979，132：493-505.［3］Miller E S，Kutter E，Mosig G，et al.Bacteriophage T4 genome［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2003，67：86-156.［4］Pascal J M，O′Brien P J，Tomkinson A E，et al.Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA［J］. Nature，2004，432：473-478.［5］Zhao B，Tong Z，Zhao G，et al.Effects of 2′-O-methyl nucleotide on ligation capability of T4 DNA ligase［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2014，46：727-737.［6］Lehman I R.DNA Ligase Structure Mechanism and Function［J］.Science，1974，186：790-797.［7］Richardson C C，Schildkraut C L，Aposhian HV，et al.Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.XIV.further purification and properties of deoxyribonucleic acid polymerase of Escherichia coli［J］.J Biol Chem，1964，239：222-232.［8］Luo J，Bergstrom DE，Barany F.Improving the fidelity of Thermus thermophilusDNA ligase［J］.Nucleic Acids Res，1996，24：3071-3078.［9］Landegren U，Kaiser R，Sanders J，et al.A ligase-mediated gene detection technique［J］.Science，1988，241：1077-1080.［10］Wu D Y，Wallace R B.Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase［J］.Gene，1989，76：245-254.［11］Takahashi M，Uchida T.Thermophilic HB8 DNA ligase：effects of polyethylene glycols and polyamines on blunt-end ligation of DNA［J］.J Biochem，1986，100：123-131.［12］Le Y，Peng J，Pei J，et al.Properties of an NAD+-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Thermotoga maritima and its application in PCR amplification of long DNA fragments［J］.Enzyme Microb Tech，2010，46：113-117.［13］Barany F.Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase［J］.Proc Natl Acad Sci，1991，88：189-193.［14］Rossi R，Montecucco A，Ciarrocchi G，et al.Functional characterization of the T4 DNA ligase：A new insight into the mechanism of action［J］.Nucleic Acids Res，1997，25：2106-2113.［15］Lohman G，Chen L X，Evans T C.Kinetics characterization of single strand break ligation in duplex DNA by T4 DNA ligase［J］. J Biol Chem，2011，286：44187-44196. ［16］Rusche J R，Howard-Flanders P.Hexamine cobalt chloride promotes intermolecular ligation of blunt end DNA fragments by T4 DNA ligase.［J］.Nucleic Acids Res，1985，13：1997-2008.［17］韩来闯，马闪闪，刘亚娟，等.构建重组质粒的二步PCR方法［J］.河南科学，2015，33（8）：1321-1325.［18］Sgaramella V，Ehrlich S e of the T4 polynucleotide ligase in the joining offlush-ended DNA segments generated by restriction endonucleases［J］.Eur J Biochem，1978，86：531-537.［19］Wang Y，Prosen D E，Mei L，et al.A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro［J］.Nucleic Acids Res，2004，32：1197-1207.［20］Wilson R H，Morton S K，Deiderick H，et al.Engineered DNA ligases with improved activities in vitro［J］.Protein Eng Des Sel，2013，26：471-478.。
T4 DNA 连接酶 #EL0011 Thermo scientific
T4 DNA Ligase ——Thermo scientific #EL0011产品信息特点快速–室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。
•该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。
•配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。
应用克隆酶切产生的DNA片段。
•克隆PCR产物。
•连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。
•定点诱变。
•扩增片段长度多态性(AFLP)。
•连接酶介导的RNA 检测(3)。
•双链DNA，RNA 或DNA/RNA 复合体中缺口的修复。
•线性DNA自身环化。
说明T4� DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5’ -磷酸基团和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。
酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA 的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性(1, 2)。
T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。
浓度1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl*一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。
来源含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌。
分子量55.3 kDa，单体。
活性单位定义1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [32PPi]转换为Norit 可吸收形式所需的酶量(Weiss单位**(4)。
酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3�µM [32PP i].** 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。
NEB常用酶介绍
NEB常用酶介绍NEB（New England Biolabs）是一家生物技术公司，专注于酶和相关试剂的研发和生产。
该公司开发了许多常用酶，其中一些被广泛应用于分子生物学和生物技术领域。
下面是一些常见的NEB酶的介绍。
1. 限制性内切酶（Restriction Enzymes）：限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位点切割DNA的酶。
NEB生产了许多常见的限制性内切酶，如EcoRI、HindIII、BamHI等。
这些酶在DNA分析、克隆以及基因组工程等领域中广泛应用。
2. DNA连接酶（DNA Ligases）：DNA连接酶能够将两条DNA分子连接起来，形成一个连续的DNA链。
NEB提供了多种DNA连接酶，如T4 DNA连接酶、Quick DNA连接酶等。
这些酶在DNA克隆和结构修复等实验中起到至关重要的作用。
3. 反转录酶（Reverse Transcriptases）：反转录酶能够将RNA模板逆转录合成DNA，从而产生相应的cDNA。
NEB开发了多种反转录酶，如M-MuLV反转录酶、AMV反转录酶等。
这些酶广泛应用于转录组学、基因表达研究以及RT-PCR等实验中。
4. 核酸聚合酶（DNA Polymerases）：核酸聚合酶是一类能够在DNA合成过程中将新的核苷酸单元加入到已存在的DNA链上的酶。
NEB提供了多种高质量的核酸聚合酶，如Phusion DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等。
这些酶在PCR、DNA扩增和DNA测序等实验中被广泛使用。
5. 电泳酶（Nucleases）：电泳酶能够在DNA或RNA的特定位置切割核酸链。
NEB生产的电泳酶包括RNase A等。
这些酶广泛应用于核酸纯化、RNA降解实验以及电泳分析中。
6. 磷酸二酯酶（Phosphatases）：磷酸二酯酶能够催化磷酸二酯键的水解反应，从而使DNA或RNA失去3'末端的磷酸基团。
NEB提供了多种磷酸二酯酶，如CIP碱性磷酸酯酶等。
t4链接法保护碱基
t4链接法保护碱基
t4链接酶是一种DNA连接酶，它在分子生物学和遗传工程领域中被广泛应用。
在保护碱基方面，t4链接酶可以通过以下方式发挥作用：
1. 修复DNA，t4链接酶能够修复DNA链上的缺口或损伤，从而保护碱基不受外界环境的影响。
它能够连接DNA链断裂的末端，恢复DNA的完整性，从而保护碱基序列的稳定性和完整性。
2. 重组DNA，t4链接酶在DNA重组过程中起着重要作用，它可以将DNA分子的末端连接起来，从而保护碱基序列不受损坏。
这对于保护DNA信息的完整性至关重要。
3. 构建基因工程载体，在基因工程中，t4链接酶常被用于构建重组DNA载体。
通过将外源DNA与载体连接，t4链接酶可以保护外源DNA的碱基序列，确保其在宿主细胞中的稳定传递和表达。
综上所述，t4链接酶在保护碱基方面发挥着重要作用，它通过修复DNA、重组DNA以及构建基因工程载体等方式，保护碱基序列
的完整性和稳定性。
这些功能使得t4链接酶成为分子生物学和遗传工程领域中不可或缺的工具之一。
T4 DNA Ligase使用说明书
T4 DNA Ligase使用说明书T4 DNA Ligase是一种重要的酶类工具，广泛应用于分子生物学领域中DNA拼接和连接的实验中。
本文将为您详细介绍T4 DNA Ligase的使用方法及注意事项。
一、T4 DNA Ligase的简介T4 DNA Ligase是一种DNA连接酶，能够嫁接DNA链断裂处的末端，形成磷酸二酯键，完成DNA片段的连接。
它在分子克隆、基因工程以及测序等领域具有重要作用。
二、T4 DNA Ligase的用途1. DNA连接：T4 DNA Ligase可用于连接DNA片段，如重组DNA、插入DNA载体等。
2. 测序修饰：在测序实验中，T4 DNA Ligase可用于修饰DNA片段，方便后续测序操作。
三、T4 DNA Ligase的使用方法1. 实验准备：将T4 DNA Ligase取出放置于冰上解冻，配制工作液。
2. 反应体系：按照实验要求配制反应体系，包括DNA片段、缓冲液、T4 DNA Ligase等。
3. 反应条件：根据实验要求确定适宜的反应温度和时间，一般在16-25摄氏度下进行反应。
4. 加酶条件：将适量T4 DNA Ligase加入反应体系中，轻轻混匀后，放置于适宜温度反应。
5. 反应终止：加入终止液终止反应，如热处理或添加酶失活液。
四、T4 DNA Ligase的注意事项1. 避免反复冻融：为保证酶活性，避免T4 DNA Ligase的反复冻融操作。
2. 注意保存条件：将T4 DNA Ligase储存在-20摄氏度干燥冰箱中，远离酶解冻或受潮。
3. 酶活检测：使用T4 DNA Ligase前应对其酶活进行检测，确保反应的准确性和可靠性。
4. 实验操作注意：在操作过程中应注意消耗性品的消耗量，避免浪费。
综上所述，T4 DNA Ligase作为一种重要的DNA连接酶，在分子生物学实验中起着关键作用。
了解并熟练掌握其使用方法，对于科研工作者来说至关重要。
希望本文所提供的使用说明书能够帮助您顺利完成实验，并取得预期的研究成果。
DNA连接酶(DNA ligase)介绍
DNA连接酶(DNA ligase)介绍DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。
二者的作用机理类似。
T4DNA连接酶作用机制：T4连接酶作用分三步：(1) T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合物。
(2) 酶－AMP复合物结合到具有5’－磷酸基和3’－羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
(3) 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。
T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA 上相邻的3 羟基和5 磷酸末断形成磷酸二脂键。
λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端（Cohesive ends），在T4 DNA 连接酶作用下，可连接成原来的线状DNA。
T4DNA连接酶连接要求和结果外源DNA末端性质连接要求连接结果不对称粘性末端两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性线形载体DNA常需磷载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；粘性末端酸酶脱磷处理重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源 DNA会以两个方向插入到载体中。
平端要求高浓度的DNA和连接酶载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。
1. 一般性质：大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。
t4连接酶发展历史
t4连接酶发展历史T4连接酶是一种重要的酶类，它在生物学研究领域具有重要的地位。
本文将探讨T4连接酶的发展历史，并从人类视角进行叙述。
T4连接酶最早是在20世纪40年代被发现的。
当时，科学家们对DNA的复制和修复机制非常感兴趣，而T4连接酶恰好是其中的一个重要环节。
在当时，科学家们还没有完全理解DNA的结构和功能，因此对于T4连接酶的研究进展缓慢。
随着科学技术的进步，人们对DNA的研究逐渐深入。
在20世纪60年代，科学家们成功地解析了DNA的结构，并发现了T4连接酶与DNA的特殊关系。
T4连接酶能够将两条DNA链连接在一起，形成一个完整的DNA分子。
这一发现引起了科学界的广泛关注，并为后续的研究奠定了基础。
在接下来的几十年里，科学家们对T4连接酶进行了深入的研究。
他们发现T4连接酶不仅可以连接DNA链，还能够修复DNA中的损伤。
这一发现对于人类的健康和疾病治疗具有重要意义。
通过研究T4连接酶的工作机制，科学家们希望能够找到治疗DNA损伤相关疾病的新方法。
随着时间的推移，科学家们对T4连接酶的研究取得了更多的突破。
他们发现T4连接酶不仅存在于T4噬菌体中，还广泛分布于其他生物体中。
这一发现使得T4连接酶的研究更加复杂和多样化。
科学家们开始探索T4连接酶在不同生物体中的功能和作用机制，希望能够揭示更多关于DNA复制和修复的秘密。
今天，T4连接酶仍然是生物学研究的热点之一。
科学家们利用现代技术手段对T4连接酶进行深入研究，并取得了许多重要的成果。
通过进一步的研究，科学家们希望能够更好地理解T4连接酶的结构和功能，为人类的健康和疾病治疗提供更多的可能性。
T4连接酶的发展历史是一个由科学家们不懈努力和不断探索的过程。
通过对T4连接酶的研究，科学家们不仅深入了解了DNA的复制和修复机制，还为疾病治疗提供了新的思路和方法。
T4连接酶的研究将继续在未来发展，并为人类的生命科学研究做出更大的贡献。
T4dna连接酶使用说明
Certificate of AnalysisProduct name/Description:T4 DNA Polymerase Cat. #:2040A Lot #:K314BA Storage Condition:-20 degrees C Shipping Condition:-20 degrees C Expiration Date:Specified on product label Package Size:100 U Package Contents: 1. T4 DNA Polymerase5 U/μl 100 U 2. 10X T4 DNA Polymerase Buffer (BSA free)1 ml 3. 0.1% BSA 10X 1 mlProduct Documents:Documents for Takara Bio products are available for download at Source: Unit Definition: Quality Control Data:Nuclease contamination test:Endonuclease activity was not detected by agarose gel electrophoresis after incubation of 1 μg ofsupercoiled pBR322 DNA with 2 units of this product for 16 hours at 37°C.Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerase gene One unit of the enzyme is defined as the amount that incorporates 10 nmol of total nucleotides intoacid-insoluble products in 30 minutes at 37°C and pH 8.8, with heat-denatured calf thymus DNAas the template-primer.It is certified that this product meets above specifications.Manager, Quality AssuranceTAKARA BIO INC.Safety Information :Please refer to our website for safety information :Notice To Purchaser :This product is for research use only. It is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals. Also, do not use this product as food, cosmetic, or household item, etc.Takara products may not be resold or transferred, modified for resale or transfer, or used to manufacture commercial products without written approval from TAKARA BIO INC.If you require licenses for other use, please contact us by phone at +81 77 543 7247 or from our website.Your use of this product is also subject to compliance with any applicable licensing requirements described on the product web page. It is your responsibility to review, understand and adhere to any restrictions imposed by such statements.All trademarks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
T4 DNA 连接酶
货号规格价格
#M0202L 100,000 units 3,029.00元
#M0202M (高浓度5x)100,000 units 3,029.00元
#M0202S 20,000 units 699.00元
#M0202T (高浓度5x)20,000 units 699.00元
#M0202V 10,000 units 349.00元
■ 提高反应效率
■粘性末端和平齐末端均可连接
■限制性酶切片段的克隆（3）
■将linker 或adapter 连接到DNA 片段的平齐末端
■室温或16 ℃均有活性
概述
该酶催化契合的双链DNA或RNA的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。
该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/ RNA杂交双链中的单链切口(1) 。
来源
纯化自E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8(2) 。
反应条件
1 X T4 DNA 连接酶缓冲液[ 50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25 ℃），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。
推荐DNA 5' 末端浓度为0.1－1.0 μM。
质保声明
无核酸内切酶和外切酶污染。
每批T4 DNA 连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出连接后DNA 末端的任何损伤。
结果表明超过99.9% 的DNA 末端保持完好。
单位定义（粘性末端活性单位）
1 单位指在20 μl 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16 ℃反应条件下，30 分钟能使50% 的经HindIII 消化的λDNA 片段[5' 端浓度为0.1
2 μM （300 μg/ml）]连接所需的酶量。
浓度
400,000 units/ml 和2,000,000 units/ml。
贮存条件
50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μg/ml BSA 和50% 甘油,-20°C 贮存。
热失活
65°C 10分钟。
室温连接反应
为方便起见，连接反应可以在室温（20-25 ℃）条件下进行。
粘性末端连接：在20 μl 反应体系中加入1 μl T4 DNA 连接酶，反应10 分钟。
平齐末端连接：在20 μl 反应体系中加入1 μl T4 DNA 连接酶反应2 小时，或者加入 1 μl 高浓度T4 DNA 连接酶反应10 分钟。
另外，NEB 快速连接试剂盒[NEB #M2200S（30 次反应），或NEB #M2200L（150 次反应）] 可在室温下5 分钟内完成平齐和粘性末端的连接。
使用注意
与大肠杆菌DNA 连接酶需要NAD+ 作辅因子不同，T4 DNA 连接酶的辅因子是ATP。
稀释后的T4 DNA 连接酶应保存于-20 ℃，50% 甘油贮存缓冲液（稀释缓冲液A，NE B #B8001）。
如稀释后马上使用，则可用1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。
只要在反应体系中补加1 mM ATP，连接反应就可以在NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液
（NEBuffer-s）或在T4 DNA 多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。
参考文献
(1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. （1982）. In P.D. Boyer（Ed.）, The Enzyme s, Vol. 5,（p. 3）. San Diego: Academic Press.
(2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., （1983）Gene, 22,103–113.
(3) Sambrook, J. et al. （1989）. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, （2nd e
d.）, （pp.1.53–1.73）. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.。