增强免疫力功能试验
低聚果糖增强小鼠免疫功能的试验
低聚果糖增强小鼠免疫功能的试验摘要：探讨低聚果糖增强免疫作用。
通过灌胃小鼠不同剂量（0.15、0.3、0.9g/kg·BW）低聚果糖，连续灌胃30d，测定各项免疫指标。
结果显示，经口给予小鼠不同剂量的低聚果糖30d，高剂量组小鼠溶血空斑数显著高于阴性对照组（P＜0.05），中、高剂量组小鼠的碳廓清吞噬指数、腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数显著高于阴性对照组（P＜0.05）。
高剂量组小鼠的NK细胞活性显著高于阴性对照组（P＜0.05），对小鼠体重及免疫器官脏器/体重比值无不良影响。
结论低聚果糖具有增强小鼠免疫力的作用。
关键词：低聚果糖；小鼠；免疫低聚果糖（Fructooligosaccharide）又称蔗果三糖族低聚糖，低聚果糖可有效地促进双歧杆菌增殖, 并能显著抑制有害菌的增殖, 具有调节肠道菌群的功能。
此外, 低聚果糖还具有提高机体免疫力、降低血脂、润肠通便等广泛的生理功能[ 1,2]。
本文通过动物试验, 研究了低聚果糖对免疫力的作用。
1材料与方法1.1受试物低聚果糖，微黄色粉末，总含量（占干物质，质量分数）95%，江苏梁丰生物工程有限公司生产。
1.2实验动物与分组 SPF级昆明种雄性小鼠，240只，体重为18～22g。
小鼠按体重随机分成6大组，每大组40只小鼠，每大组又分为4组，样品低、中、高剂量组及阴性对照组，每组10只小鼠。
1.3剂量设计样品低、中、高剂量组分别为0.15、0.3、0.9g/kg·BW，将低聚果糖用纯化水配置成不同浓度的受试物液。
按20mL/kg.BW的体积灌胃，阴性对照组予以等体积的纯化水，每天灌胃一次，连续灌胃30d。
1.4试验项目分别进行各项免疫试验：ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT 法）、二硝基氟苯诱导的小鼠 DTH 实验（耳肿胀法）、抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）、血清溶血素的测定（血凝法）、小鼠碳廓清实验、NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）[3]。
牛磺酸增强免疫力功能研究
牛磺酸增强免疫力功能研究[摘要]目的研究牛磺酸对机体免疫功能的作用。
方法给予小鼠不同剂量的牛磺酸，观察其对小鼠巨噬细胞吞噬能力--碳廓清实验、NK细胞活性实验和小鼠迟发型变态反应的影响。
结果牛磺酸显著增加小鼠碳廓清指数、小鼠足趾肿胀度，对NK细胞的活性无明显影响。
结论牛磺酸具有一定的降脂和增强免疫力作用。
[关键词]牛磺酸、免疫、巨噬细胞牛磺酸是一种含硫的氨基酸，牛磺酸在哺乳动物的脑、心、肝、肾、视网膜、骨骼肌和白细胞等组织器官中含量丰富，是体内含量最高的游离氨基酸，牛磺酸不是蛋白质的组成成分，却是一种条件性必需氨基酸。
它不仅作为一种营养物质参与机体的生长代谢，而且参与维持机体的免疫功能，对神经、消化、生殖、心血管、免疫和内分泌等生理功能的正常发挥具有重要的调节作用。
本实验着重研究牛磺酸对小鼠免疫力功能的影响。
1材料与方法1.1受试样品：牛磺酸。
1.2实验动物：SPF级昆明种雌性小鼠120只，体重18-22g，用于增强免疫功能实验。
动物均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
1.3主要仪器与试剂：动物天平、电子天平、酶标仪、恒温水浴锅恒温培养箱、显微镜；1.4剂量分组及受试物给予：小鼠随机分为三个实验组，每组40只小鼠。
免疫实验一组进行迟发型变态反应实验；实验二组进行淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验；实验三组进行NK细胞活性实验。
每组实验设置低、中、高三个剂量组和一个空白对照组，三个剂量组分别为42 mg/kg.bw、83 mg/kg.bw、250mg/kg.bw剂量组以不同剂量牛磺酸灌胃小鼠。
2试验方法增强免疫功能实验按照《保健食品检验与评价技术规范》2003年版（功能学评价检验方法）“增强免疫力实验方法评价”相关标准进行实验。
试验数据统计采用SPSS 17.0统计软件进行结果处理。
采用单因素方差分析与组间 LSD 检验。
P＜0.05表示差异有统计学意义。
3结果与分析3.1对小鼠体重的影响：实验初期、中期、末期，各实验剂量组小鼠体重与空白对照组比较均无明显变化，差异均无显著性（P＞0.05）。
方剂实验报告
一、实验目的1. 熟悉中药方剂的制备过程。
2. 掌握四君子汤的制备方法。
3. 了解四君子汤的药效及其临床应用。
二、实验原理四君子汤为中医经典方剂，具有健脾益气、调和脾胃的功效。
方中人参、白术、茯苓、炙甘草四味药合用，可增强脾胃功能，提高机体免疫力。
本实验旨在通过制备四君子汤，观察其药效，为临床应用提供理论依据。
三、实验材料1. 药材：人参、白术、茯苓、炙甘草。
2. 仪器：电子天平、煎药机、药筛、容量瓶、移液管、烧杯、玻璃棒等。
3. 试管、培养皿、显微镜、电子分析天平等。
四、实验方法1. 方剂制备（1）称取人参、白术、茯苓、炙甘草各10g，放入煎药机中。
（2）加入适量水，煎煮30分钟。
（3）过滤，取滤液，加入适量的蒸馏水，定容至100ml。
2. 药效评价（1）健脾益气作用将实验动物分为实验组和对照组，实验组给予四君子汤，对照组给予生理盐水。
观察两组动物体重、食欲、活动力等指标。
（2）调和脾胃作用将实验动物分为实验组和对照组，实验组给予四君子汤，对照组给予生理盐水。
观察两组动物粪便颜色、形状、气味等指标。
（3）提高免疫力作用将实验动物分为实验组和对照组，实验组给予四君子汤，对照组给予生理盐水。
采用淋巴细胞转化试验、碳廓清试验等方法，观察两组动物免疫力。
五、实验结果1. 方剂制备成功制备了四君子汤，其外观呈棕黄色，无沉淀。
2. 药效评价（1）健脾益气作用实验组动物体重、食欲、活动力等指标均优于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。
（2）调和脾胃作用实验组动物粪便颜色、形状、气味等指标均优于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。
（3）提高免疫力作用实验组动物淋巴细胞转化率、碳廓清率等指标均优于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。
六、实验结论1. 成功制备了四君子汤，其外观呈棕黄色，无沉淀。
2. 四君子汤具有健脾益气、调和脾胃、提高免疫力等作用。
3. 四君子汤在临床应用中具有良好的疗效，可为中医临床治疗提供理论依据。
实验三十四增强免疫力功能试验
实验三十四增强免疫力功能试验一、实验目的与要求1 熟悉动物实验的操作技术与要求；2 掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。
二、实验原理1 免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。
健全的免疫系统主要有三大功能：（1）防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；（2）稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；（3）监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。
2 机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。
三、实验仪器与试剂1 仪器（1） 200目筛网；（2） 24孔培养板；（3） 96孔培养板（平底）；（4）玻片架；（5）微量血凝实验板；（6）血色素吸管；（7）手术器械；（8）打孔器；（9）计时器；（10）二氧化碳培养箱；（11）超净工作台；（12）恒温水浴；（13）离心机；（14）酶标仪；（15） 721型分光光度计；（16）显微镜。
2 试剂（1）生理盐水；（2）丙酮；（3）甲醇；（4）盐酸；（5）异丙醇；（6） DNFB；（7）麻油；（8）硫化钡；（9） Na2CO3；（10） RPMI1640细胞培养液；（11）小牛血清；（12） 2巯基乙醇（2ME）；（13）青霉素；（14）链霉素；（15）刀豆蛋白A（ConA）；（16） Hank s液；（17） PBS缓冲液（pH7.2~7.4）；（18） SA缓冲液；（19）琼脂糖；（20）印度墨汁；（21） SRBC；（22）鸡红细胞；（23） YAC1细胞；（24）补体（豚鼠血清）；（25） MTT；（26） Giemsa染液；（27）乳酸锂或乳酸钠；（28）硝基氯化四氮唑（INT）；（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）；（30） NAD；（31） 0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）；（32） 1%NP40或2.5%Triton。
免疫学实验设计——证实一产品有免疫增强作用(从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑)
实验操作
(三)方法与结果: 1.淋巴细胞提取 (1)取人抗凝血3毫升，分成3份编号1.2.3，向2.3号中加入适量药品，向1.2.3中
分别加入1毫升Hanks液使之稀释。分别加于1毫升淋巴细胞分层液液面之上 (沿管壁轻轻加入，勿使两液相混)。 (2) 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另试管中加 5倍体积的Hanks液洗 1~2次，(1500转/分离心 10分钟)弃上 清即成。
材料
1、主要材料: 消毒肝素抗凝管(内含肝素10~20单位) 、注射器、微量加样器、
微量细胞培养板、49型玻璃纤维滤膜、离心机、细胞培养箱、 干燥箱、多头细胞收集器， FJ-2107液体闪烁计数仪。 2、主要试剂 完全RPMI-1640培养液(内含 15% FCS, 25mM Hepes, 5x102 mM= 巯基乙醇), 植物血凝素 (PHA，用完全RPMI- 1 640配成浓 度为30 ug/ml) ; H-TdR.工作液18.5KBq/20ul (中国原子能研 究院b同位素所)。 闪烁液(二甲苯1000 ml,ppo 7 g,popop0.5g) 。
证实一产品有免疫增强作用
（从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑）
从T细胞功能的角度考虑
3H-TdR渗入法检测淋巴细胞转化率
实验原理：
胸腺嘧啶核苷(TdR) 是DNA合成的前身物。人外周血T淋巴细胞 在PHA刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄 取TdR用以合成DNA。与此同时，H-TdR也不断地被摄入细胞内 而被放射性标记。通过液体闪烁计数测量方法，便可了解淋巴 细胞增殖活动的情况，籍以了解机体的细胞免疫功能。
实验操作
④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻 璃纤维滤膜_上，将滤膜置烤箱内烘干。
梅花鹿茸和马鹿茸增强免疫力功能的研究
梅花鹿茸和马鹿茸增强免疫力功能的研究【摘要】目的：研究梅花鹿茸和马鹿茸增强免疫力的功能。
方法：将梅花鹿茸和马鹿茸分别按传统方法煎煮，得到的提取物分别按梅花鹿茸提取物6.25、12.5、37.5mg/kg BW 及马鹿茸提取物6.0、12.0、36.0mg/kg BW，各3个剂量，依照《保健食品检验与评价技术规范》增强免疫力功能检验方法，灌胃给予实验小鼠，同时设阴性对照组（蒸馏水），每天灌胃1次，连续30天。
结果：在小鼠迟发变态反应中，梅花鹿茸和马鹿茸的高剂量组与阴性对照组比较，具有统计学意义（P＜0.05），能增强细胞免疫功能，在小鼠单核-巨噬细胞的碳廓清能力试验中，低、中、高剂量组与阴性对照组比较，具有统计学意义（P＜0.05），即能增强单核-巨噬细胞功能；在抗体生成细胞数、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、NK细胞活性试验中，各剂量组与阴性对照组比较，无统计学意义（P＞0.05）。
结论：梅花鹿茸和马鹿茸均具有增强免疫力功能作用，梅花鹿茸在增强免疫力方面略优于马鹿茸的作用。
鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科的动物梅花鹿(Cerv us Nippon Temminck)或马鹿(C.elaphus L.) 雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是我国传统的名贵中药之一[1-3]，也是我国特有的药用资源。
鹿茸具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒等功效，用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、赢瘦、神疲、畏寒、眩晕、耳鸣、耳聋、腰脊冷痛、筋骨痿软、崩漏带下、阴疽。
根据鹿茸的来源，可分为梅花鹿茸和马鹿茸；为了考察两种鹿茸增强免疫力功能的差异，进行了如下研究。
1 材料和方法1.1 样品：梅花鹿茸和马鹿茸的水提取物（分别用梅花鹿茸和马鹿茸饮片8倍量的水提取3次，每次提取2小时，提取后过滤，合并提取液，干燥得提取物，梅花鹿茸和马鹿茸的提取率分别为12.5%和12.0%）。
1.2 实验动物：雄性小鼠240只，体重18g～22g，生产许可证号：2016-0004。
保健食品27种功能及试验检测项目
保健食品主要分为营养素补充剂和具有调节机体功能的功能性产品。
（1）营养素补充剂：指以补充一种或多种维生素、矿物质而不以提供能量为目的的产品。
其作用是补充膳食供给的不足，预防营养缺乏和降低发生某些慢性退行性疾病的危险性。
此类产品仅限于补充维生素和矿物质。
（2）国家食品药品监督管理局公布的保健食品的27种功能：（申请功能数量不受限制）
1、增强免疫力功能15、抗氧化功能★
2、改善睡眠功能16、辅助改善记忆功能★
3、对化学性肝损伤有辅助保护功能17、促进排铅功能★
4、增加骨密度功能18、清咽功能★
5、提高缺氧耐受力功能19、辅助降血压功能★
6、对辐射危害有辅助保护功能20、促进泌乳功能★
7、缓解体力疲劳功能◇ 21、减肥功能★◇
8、缓解视疲劳功能☆22、改善生长发育功能★◇
9、祛痤疮功能☆23、改善营养性贫血功能★
10、祛黄褐斑功能☆24、调节肠道菌群功能★
11、改善皮肤水份功能☆25、促进消化功能★
12、改善皮肤油份功能☆26、通便功能★
13、辅助降血脂功能★27、对胃黏膜损伤有辅助保护功能★
14、辅助降血糖功能★
注：标有★的功能，既需要进行动物功能试验又需要进行人体功能试验。
标有☆功能，只需进行人体功能试验，无需进行动物功能试验。
标有◇的项目需做兴奋剂检测。
拟申请的功能不在以上公布的27种范围内的，申请人应当自行进行动物试验和人体试食试验，并向确定的检验机构提供功能研发报告。
黄精对增强免疫力和缓解体力疲劳功能试验研究报告
黄精对增强免疫力和缓解体力疲劳功能试验研究报告【摘要】目的研究黄精对运动小鼠增强免疫力和缓解体力疲劳作用。
方法采用小鼠灌胃，进行黄精增强免疫力和缓解体力疲劳试验。
结果增强免疫力试验中，中、高剂量组能提高小鼠迟发型变态反应（P<0.01），高剂量组能提高小鼠血清溶血素试验中抗体积数（P<0.05），中、高剂量组能提高碳廓清能力和巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力（P<0.05）；缓解体力疲劳功能试验中高剂量组( 1.5g / kg)能显著延长小鼠的力竭游泳时间 ( P＜0. 05)，显著增加肝糖原储备（P<0.05）；中（0.5g / kg·bw）、高剂量组（1.5g / kg·bw）能显著降低小鼠血清尿素含量（P<0.05，P<0.01），显著减少血乳酸曲线下面积（P<0.05，P<0.01）。
表明黄精具有缓解体力疲劳作用。
结论黄精具有增强免疫力和缓解体力疲劳功能。
关键词：黄精；体力疲劳；免疫黄精( Polygonatum sibiricum) 药用历史悠久，是常用的药食同源植物。
距今已有 2000 多年历史，中医古方黄精地黄丸、二精丸等至今仍在应用。
《神农本草经》中记载: “黄精，味甘、平、无毒，主补中益气，除风湿，安五脏，久服轻身，延年不饥”。
现代研究表明，黄精中含有多糖、黄酮、低聚糖、生物碱、甾体皂苷、氨基酸等多种化学成分［1］，具有降血糖、抗氧化、增强免疫力、抗菌抗炎等多种药理作用［2-5］。
黄精也是保健食品原料，黄精作为药食同源物品正被广泛用于保健食品的开发中，截止目前，以黄精为主要原料申报的保健食品1000多种，申报的保健功能主要集中在增强免疫力、缓解体力疲劳、辅助降血糖等。
随着黄精经济价值和社会效益日渐突出，在保健食品领域有着巨大的开发潜力和广阔的市场前景。
本试验采用小鼠灌胃给药，设三个剂量组和阴性对照组，进行了黄精的增强免疫力和缓解体力疲劳试验，为开发具有增强免疫力和缓解体力疲劳功能的黄精类产品提供理论依据。
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增强免疫力功能试验一、实验目的与要求1熟悉动物实验的操作技术与要求；2掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。
二、实验原理1免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。
健全的免疫系统主要有三大功能：1)防御功能——保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；2)稳定清洁功能——不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；3)监控功能——及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。
2机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。
三、实验仪器与试剂仪器试剂（1）200目筛网（2）24孔培养板（3）96孔培养板（平底）（4）玻片架（5）微量血凝实验板（6）血色素吸管（7）手术器械（8）打孔器（9）计时器（10）二氧化碳培养箱（11）超净工作台（12）恒温水浴（13）离心机（14）酶标仪（15）721型分光光度计（16）显微镜（1）生理盐水（2）丙酮（3）甲醇（4）盐酸（5）异丙醇都氏试剂（碳酸氢钠 1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）（9）Na2CO3（10）RPMI1640培养液（11）小牛血清（12）2巯基乙醇（2ME）（13）青霉素（14）链霉素（15）刀豆蛋白A（ConA）（16）Hank’s液（17）PBS缓冲液（pH7.2~7.4）（18）SA缓冲液（19）琼脂糖（20）印度墨汁（21）SRBC（22）鸡红细胞（23）Y AC-1细胞（24）补体（豚鼠血清）（25）MTT（26）Giemsa染液；（27）乳酸锂或乳酸钠；（28）硝基氯化四氮唑（INT）（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）（30）NAD（31）0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）（32）1%NP40或2.5%Triton四、实验方法与步骤1样品处理与给予方式（1）对于水溶性样品，用蒸馏水配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物；对于脂溶性样品，用调和油配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物。
（2）受试样品推荐量较大，超过实验动物的灌胃量、加入饮水或掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品中的非功效成分的含量。
（3）对于含乙醇的受试样品，原则上应使用其定型的产品进行功能实验，其三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。
如受试样品的推荐量较大，超过动物最大灌胃量时，允许将其进行浓缩，但最终的浓缩液体应恢复原乙醇含量。
如乙醇含量超过15%，允许将其含量降至15%。
调整受试样品乙醇含量应使用原产品的酒基。
（4）液体受试样品需要浓缩时，应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。
一般可选择60~70℃减压进行浓缩。
浓缩的倍数依具体实验要求而定。
（5）对于以冲泡形式饮用的受试样品（如袋泡剂），可使用该受试样品的水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。
如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取的条件：常压，温度80~90℃，时间30~60min，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需浓度。
（6）必须经口给予受试样品，首选灌胃。
如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。
（7）以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。
2动物实验（1）动物选择：推荐用近交系小鼠，20g±2g，单一性别，每组10~15只。
（2）剂量分组：实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组，另设两个剂量组，必要时设阳性对照组。
（3）样品给予时间：所有试验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。
给予受试物的灌胃体积为20ml/（kg·Bw）。
受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。
3指标检测A ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）1)试剂配制i完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1% Pen/Strep/Glutamine (100×, liquid)及5×10-5mol/L的β-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0~7.2，即完全培养液。
ii ConA液：用双蒸水配制成100μg/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）中保存。
iii无菌Hank’s液：用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH7.2~7.4。
iv MTT液：将5mg MTT溶于1ml pH7.2的PBS中，现配现用。
v酸性异丙醇溶液：96ml异丙醇中加入4ml 1mol/L的HCl，临用前配制。
2)脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。
经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。
然后将细胞悬浮于1ml完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/ml。
3)淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液（相当于7.5μg/ml），另一孔作为对照，置5% CO2，37℃ CO2孵箱中培养72h。
培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）50μl/孔，继续培养4h。
培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。
然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3~6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。
也可将溶解液直接移入2ml比色杯中，721型分光光度计上在波长570nm测定OD值。
B抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）1)SRBC：绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
2)制备补体：采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1ml压积SRBC加入5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70℃保存。
用时以SA缓冲液按1∶8~15稀释。
3)玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g琼脂糖加双蒸水至100ml，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。
4)免疫动物：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 5×107~2×108个。
也可将压积SRBC用生理盐水配成2%（V/V）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。
5)脾细胞悬液制备：将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1000r/min）10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ml。
也可将细胞悬浮在8ml Hank’s液，测定脾空斑形成数。
6)空斑的测定：将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100ml）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2~7.4的2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl 10%SRBC（V/V，用SA液配制），20μl脾细胞悬液（5×106个/ml）或25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1~1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1∶8）加到玻片架凹槽内，继续温育1~1.5h后，计数溶血空斑数。
C半数溶血值(HC50)的测定原理:用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体(溶血素)，与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量.仪器和材料:721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都式试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)实验步骤:1)SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
2)制备补体:采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，使用前将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，－70℃保存。
用时以SA液按1∶10稀释。
3)免疫动物及血清分离:取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。
将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。
4～5d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min 离心10min，收集血清。
4)溶血反应:取血清用SA缓冲液稀释(一般为200～500倍)。
将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA液按1：10稀释)，另设不加血清的对照管(以SA液代替)。
置37℃恒温水浴中保温15～30min后，冰浴终止反应。
2000r/min离心10min。
取上清液1mL，都氏试剂3mL于试管内，同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
5)数据处理及结果判定:一般用方差分析进行数据统计，溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下列公式计算，受试物组的HC50显著高于对照组的HC50，即可判定该项试验结果阳性。
D小鼠碳廓清实验1)溶液配制i注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释3~4倍。
ii Na2CO3溶液取0.1g Na2CO3，加蒸馏水至100ml。
2)注射墨汁：称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1ml计算。
待墨汁注入，立即计时。
3)测定：注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml 0.1% Na2CO3溶液中。
用721型分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。