酪蛋白磷酸肽酶解工艺条件的优化研究

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对不同温度酶解液制备酪蛋白磷酸肽的探讨

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ＣＰ产品和标准品配置成３％的溶液１０ｍ，并调Ｐｓ０Ｌ
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ｐＨ至８，．微孔过滤后上Ｓｐａｅ一５柱，０ｅｈｄｘＧ２检测波长
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１．酪蛋白磷酸肽的检测．３３总氮含量用微量凯氏定氮法测定，算氮与磷的计
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关键词：酪蛋白磷酸肽；葡聚糖凝胶；离纯化；／（尔比）分ＮＰ摩
ＤｉｃｓｏｆＰｒｐａａｉｎｏｓｉＰｈｏｐｈｐｅｉｓｏｚｓｕｓｉｎｏｅｒｔｏｆＣａｅｎｓｏｔｄｅｆＥｎｙｍｅＳｌｔｏｔＶａｉｕｍｐｅａｕｒｓｏｕｉｎａｒｏｓＴｅｒｔｅ

生物实验：酪蛋白磷酸肽制备

动物对矿物质离子的吸收利用。在低钙日粮中CPPs可提高蛋鸡的蛋壳强度，增强机体的体质，减少腿病的发生。在种猪日粮中添加CPPs能显著提高卵细胞的受精率，提高种蓄繁殖性能。对怀孕母蓄及种用家蓄，防止营养性缺铁贫血，显著提高仔猪血清中特异性IgA、IgM、IgG 的含量，从而增强仔猪的免疫力。
CPPs①安全性好。制取CPPs的原料是一种天然蛋白质，且CPPs对畜禽健康毫无损害。②稳定性好。 CPPs在常温下稳定性好，防止钙沉淀，商品CPPs在5℃ 和25℃保存两年后，其功能指标仅下降1%和3%。③成本低。CPPs在实际添加量非常小的情况下就能起到很有效的促进作用，且其加工工艺日趋完善，生产成本也将逐步降低。
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10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。12:45:4512:45:4512:457/12/2021 12:45:45 PM
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11、一个好的教师，是一个懂得心理学和教育学的人。21.7.1212:45:4512:45Jul- 2112-J ul-21
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酪蛋白磷酸肽的生物活性表现为，在pH呈中性至微碱性的动物小肠下端,能与Ca+2、Fe+2和Zn+2等金属离子结合,阻止这些金属离子与磷酸根结合产生沉淀,使小肠内可溶性的钙、铁和锌的浓度增加,从而促进这些必需金属离子的吸收和利用。

酪蛋白磷酸肽及其在食品工业中的应用

Sample
Concentration (mg/ml)
GSH(nmol/mg protein)
CAT (sec-1/mg protein)
SOD (U/ml cell homogenate)
GSH-Rd (% of control)
GSH-Px (% of control)
Control
CPPs
1
钙一乙醇沉淀法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白一胰蛋白酶水解一酪蛋白水解液一钙一乙醇沉淀一分离一干燥--CPPs产品
膜分离法生产CPPs的工艺路线：酪蛋白一酪蛋白水解液一过滤一分离一喷雾干燥一CPPs产品
典型的CPPs制备工艺
⑴ 酶解
目前，一般采用专一性蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、Alcalase(DH一16%～20% )、胃蛋白酶一胰蛋白酶、胰蛋白酶一中性蛋白酶、凝乳酶一胰蛋白酶等，水解酪蛋白制取CPPs。
–液态奶、乳饮料、婴幼儿奶粉、学生配方奶、高钙低脂奶等
• 儿童营养食品
– 婴儿营养米粉、高钙饼干等
• 豆制品
– 高钙豆奶粉、钙豆腐等
• 防龋齿的牙膏、口香糖等 • 啤酒等含气饮料
– 可使泡沫细腻、持久，并促进其中的矿物质吸收
3.5 CPPs的其他应用
• CPPs在医学上的应用
–佝偻病、牙科病、骨质疏松症等疾病的治疗 –制备促进动物体外受精、细胞融合的生化制剂
在降低水解所用酶成本方面，国内学者采用了固定化酶体系。吴思方等通过正交试验确定了固定化酶酶解酪蛋白生产CPPs的最佳工艺条件。
陈庆森等确定了固定化最佳条件,以GM201为载体的固定化酶活力回收为19%,而以壳聚糖为载体的固定化酶活力回收达到了66%以上,其最适温度为 45℃,最适pH8.0,最适底物浓度为4.0%,利用固定化酶水解酪蛋白40min所制备CPPs的产率达7.54%。

天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽研究进展

天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽的研究进展摘要：酪蛋白磷酸肽( CPPs) 是含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽，现已证明，CPPs 具有重要生理功能。

本文就CPPs 的结构、理化性质、制备工艺、检测方法、生理功能及应用进行了系统的概述。

关键词：酪蛋白磷酸肽；结构；制备；生理功能；应用引言酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphope Ptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽[1]。

CPPs能促进机体肠粘膜对钙、铁、锌和硒，尤其是钙的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。

CPPs是目前唯一促进钙吸收的活性肽，同时在提高机体免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用。

日本、德国等国家已把CPPs定为功能性食品，与CPPs相关的研究越来越受到我国科学家和食品工作者的广泛关注。

1 CPPs的结构牛乳酪蛋白的主要成分为αs1、αs2、β和κ-酪蛋白，除κ一酪蛋白外，α和β一酪蛋白都具有成簇存在的磷酸丝氨酸残基(Ser一P)。

酪蛋白经体外酶水解后，产生CPPs，CPPs的核心部位是由3个磷酸丝氨酸残基组成的一个一Ser(P)一残基簇，后面紧接着2个一Glu一残基，即一serP一SerP一SerP一Glu一Glu一，现已证明这个结构是发挥其生物活性必不可少的。

Hiroshil等1974年用动物实验表明，酪蛋白可在动物体内形成CPPs，并确定其结构为serP一serP-SerP一Glu一Ile一Pro一Asn。

1996年Nieholasf 习等用胰蛋白酶水解酪蛋白，得到包含有一SerP一SerP一SerP-Glu一Glu一序列的CPPs，从而得知了CPPs实际上是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽，其产品分子量不均一[2]。

2 CPPs的理化性质2.1 溶解性 CPPs 产品具有良好的溶解性，其pH值为2.0～10.0，其溶解性除在pH值4.0 约为90%外，其他均高于90%，且溶解性随 pH 值的增高而增大。

酪蛋白酶解产物的结构特征研究

酪蛋白酶解产物的结构特征研究柳甜甜;王金水;高芸芳;李晓伟;周晓配;贾峰【摘要】用超声波对酪蛋白进行预处理之后,利用胰蛋白酶对其进行酶解,检测酶解后产物的表面特征、粒度分布及二级结构等指标,探讨酪蛋白酶解产物的结构特征变化特征.结果表明:用超声波辅助处理后,酪蛋白酶解液的酶解产物与未采用超声波辅助处理的结果相比,产物的粒度更小且分布均匀,酪蛋白表面的孔洞化和层片化更快,随着酶解时间的延长,酪蛋白酶解产物颗粒的粒度变小,分子量分布更加均匀;酪蛋白酶解产物中β-转角和无规则卷曲减少,而β-转角的含量增加.结果表明超声波辅助处理对酶解酪蛋白有很好的促进的作用.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2016(037)008【总页数】6页(P14-19)【关键词】酪蛋白;酶解产物;二级结构;超声波;傅里叶红外光谱(FTIR)【作者】柳甜甜;王金水;高芸芳;李晓伟;周晓配;贾峰【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001【正文语种】中文酪蛋白（casein，CN）是牛乳中的主要蛋白质，分子质量大约为20 kDa～25 kDa，呈酸性，由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四类组分组成[1]，是一类含磷的蛋白质[2]，能够协助参与核酸、三磷酸腺苷（ATP）等重要的代谢活动。

但是由于这4种单体通过α-螺旋、β-折叠和β-转角等蛋白质二级结构形成了紧密的酪蛋白空间结构，使其在人体内消化困难，且易过敏，这些因素限制了酪蛋白在食品领域的应用。

然而，近年来在酪蛋白水解物中发现很多具有重要生理功能的多肽，如：阿片肽[3]、降血压肽[4]、抗血栓肽、免疫促进肽[5]、促进矿物离子吸收肽等，而这些多肽大约在1 000 Da左右，容易被肠道吸收[3]。

酪蛋白酶解制活性肽的工艺条件

ＴｃｎｌｇｆｂｉｉｅｓｔｆｅｈｏｏｙＷｕａ３０８Ｈｕｅ，ｈｎ）ｅｈｏｏｙｏｅｖｒｉｏｃｎｌｇ，ｈｎ４０６，ｂｉＣｉａＨｕＵｎｙＴ
Ａｂｔａｔｈｓｅｐｒｍｅｔｈｉｅｐｎｒａｎｙｏｐｅａａｉｎｂｏｃｉｅｐｐｉｅ．Ｕｓｄｏｙｉｇｅ，ｓｒｃ：ＴｉｘｅｉｎｏｃａｃｅｓｅｚｍｅｔｒｐｒｔｉａｔｖｅｔｄｓｃｏｅＨｙｒｌｓｓＤｅｒｅＨｙｒｌｓｓａｅｔＵｉｔｂｔｎｏｒｏｎｔｅｐｒｍｅｔｈｉｅｅｔａｔｒｂｕｓｂｔａｅｕｓｒｔｄｏｙｉｒｔ，，ｄｓｒｕｉｆｕｐｉｔｏｘｅｉｏｉｎ，ｃｏｃｂｓｆｃｏａｏｔｕｓｒｔ，ｓｂｔａｅｃｎｅｔａｉｎｔｍｐｒｔｒ，ｉｆｈｄｏｙｉ．ｉｄｂｓｅｉｎｔｍｐｒｔｒ：，ｕｓｒｔｏｃｎｒｔｎ６％，ｏｓｎｒｔ，ｅｅａｕｅｔｍｅｏｙｒｌｓｓＦｎｅｔｄｓｇ：ｅｅａｕｅ４０Ｓｂｔａｅｃｎｅｔａｉ：ｏｏｅｚｍｅｃｎｅｔａｉｎ２％，Ｈ：，ｙｒｌｓｓｔｍｅ１０ｍｉ．ｎｙｏｓｎｒｔ：ｏｐ７ｈｄｏｙｉｉ：２ｎＫｅｒｓ：ａｅｎ；ｐＨ；ｅｚｍｅｕｓｒｔｏｃｎｒｔｎ；ｔｍｐｒｔｒｙｗｏｄｃｓｉｎｙ；ｓｂｔａｅｃｎｅｔａｉｏｅｅａｕｅ；ｔｍｅｉ

食品生物技术

停留时间分布函数实验测定
循环体系先以磷酸缓冲液做补液,待渗透通量稳定后,将补液迅速切换为已制得的多肽水解液(经6000Da中空纤维膜过滤),并连续检测280nm下渗流液的吸光度值变化。
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1.材料与方法 1.材料与方法
Page 7ຫໍສະໝຸດ 2.理论分析 2.理论分析
动力学模型推导如下：对连续酶解反应过程做如下简化与假设: ①近似认为超滤膜组件对胰蛋白酶及酪蛋白完全截留； ②酶解前经底物循环保护后可忽略膜组件对该酶的活性影响； ③酶解单元遵循单底物拟均相不可逆酶促反应动力学方程； ④酶解操作达稳态时因体积 V反应器》V中空纤维膜，渗透通量 J循环》J 渗流，故可认为CSTR/UF的动力学行为近似等效于 CSTR； ⑤暂不考虑物质在膜上的传质行为。
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3.结果与讨论 3.结果与讨论
3.5 CSTR/UF组合酶膜反应器中胰蛋白酶连续水解酪蛋白动力学建模
3.5.1停留时间分布函数验证图7为升阶示踪应答法检测得到的停留时间分布函数。可见,CSTR/UF反应器F(t)函数的实验测定值与理想全混流反应器CSTR 的理论分布函数 F(t)=1-e -t/(V/J) 相吻合,可认为二者具有相同的操作方程, 这与模型推导中所做假设(4) 一致。
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3.结果与讨论 3.结果与讨论
3.5.2 动力学模型拟合验证
代入X与修正空时之间的函数关系式(1)得到模型拟合曲线,见图8, 理论计算值与实验测定值之间的平均相对误差为10.63%,这可能是因为在简化建模时未考虑酶解反应的膜上行为所致。此外,忽略反应过程中因剪切或生热所造成的酶蛋白失活而引入的正误差是造成τ增大时,拟合值整体偏高的主要原因。

酶解酪蛋白生产生物活性肽的研究现状及开发前景

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抗高血压肽 DEB=;AF351=5B?;G5 353=;<5H 血管紧张素转化酶 &E)I ’ 是一种多功能的酶 !
$
&!’ 基因工程方法 $ 采用基因工程技术 7 让某些功能明确的活性肽在工程细菌或工程动植物中得到高效表达 7 从而达到商业化生产的目的 $ 人们在这方面的工作还是初步的! 在转基因鼠的乳汁中得到了牛乳 !! 酪蛋白的表达产物 ! 并且进行了纯化 ! 牛乳的"! 乳白蛋白也在转基因鼠的乳汁中得到表达 $8%$ 通过基因工程的方法生产分子量较大的肽和蛋白质已被广泛应用! 而许多生物活性肽都是短肽! 所以也限制了这种方法的使用 $ & "’ 化学合成方法 $ 化学合成法用于生产高价的药理级肽! 但是此法的成本相当高! 而且副产物会对人体有害 ! 因此使用受到限制 $ 总之! 目前生物活性肽的研究开发主要采用微生物蛋白酶的方法! 国内外在植物蛋白和动物蛋白的开发研究中利用的微生物蛋白酶已建立的良好的实验依据! 发现微生物蛋白酶大多具有溶解性好(
56.76,89:; )*+,- 水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物中
都分离到了 !#) 酪蛋白 & ./0(*12(312 ’ 和 ! ! 酪蛋白 &405(*12(*12 ’ 具有降血压作用的肽段 ! 但是此法存在对菌种依赖性较大! 如果没有优良的发酵菌种! 那么降低生产成本而实现工业化生产必然存在许多困难* 另外还存在菌种的安全评价和相关产物分析等问题
$
& ’’ 微生物发酵法 $ 此法生产多肽是近年来逐步发展起来的很前景的技术! 直接利用微生物发酵过程中产生的蛋白酶 &复合 ’ 降解蛋白质 ! 可达到较高的水解度! 从而相对地降低酶法生产活性肽的成本 ! 例如 ! 在接种了 23456.76,89:; 的牛乳和用 234

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解所得的一系列含有磷酸丝氨酸族的天然生这又取决于酪蛋白磷酸肽
制备工艺中所使用的酶。尽管早在５０年前，国外就开始了对ＣＰＰ的研究，但工业化制备的研究工
作直到近年才真正开始，而我国在酪蛋白磷酸肤的研究方面尚未完全实现产业化生产，现有的生产中往往采用单一酶水解，存在水解度低、酶消耗量大、底物浪费、ＣＰＰ成本高的问题。因此提高酶的转化率、研究生产天然的ＣＰＰ，实现大规模生产，不断满足人们对ＣＰＰ的需要将是其发展必然趋势。
Ｔｈｅｃｐｐｓ，Ｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎａｖａｉｅｒｔｙｏｆｎｕｔｉｔｒｉｏｎａｎｄｈｅｌｔａｈｆｏｏｄ，ｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍ．ｉｒｏｎ。ｚｉｎｃａｎｄｏｔｈｅｒｄｉｖａｌｅｎｔｍｉｎｅｒａｌｎｕｔｉｒｅｎｔ．ｄｉｆｅｒｅｎｔｋｉｎｄｓｏｆｅｎｚｙｍｅｏｆｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ，ｐｒｅｆｅｒｒｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｐｐｓｙｉｅｌｄｏｆＬＣ一１ｅｎｚｙｍｅ，Ｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｐＨ８，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５０ｄｅｇｒｅｅｃｅｌｓｉｕｓ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ１０％，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｔｉｍｅ２ｈ．Ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｔｅｓｔｖｌｉａｄａｔｉｏｎ．ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＣＰＰｗａｓ２２．３％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｌｋｃａｓｅｉｎ；ｃａｓｅｉｎｐｅｐｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ
酪蛋白磷酸肽酶解工艺条件的优化研究
彭维，刘丽，刘飞，欧爱芬
（１．广州医科大学，广州５１０１８２；２．广州绿萃生物科技有限公司，广州５１０５３０；３．广州市药品检验所，广州５１０１６０）
摘要：酪蛋白磷酸肽（ｃＰＰ）是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得的具有生物活性的多肽，能
中图分类号：ＴＳ２０２．３文献标识码：Ａ文章编号：１００６— ２５１３（２０１４）０１ — ０１８８一ｏ４
ＥｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃａｓｅｉｎｐｈＯＳｐｈＯｐｅｐｔｉｄｅｓ
我国民众膳食组成以植物性食物为主，其中含
有大量的影响钙、铁、锌吸收的因子，如植酸、草
用Ｊ。研究表明，酪蛋白磷酸肽的这些生理活性与其分子中氨基酸组成和排列顺序（或磷酸丝氨
酸、纤维素等。因此，中国人缺钙尤为严重。酪蛋白磷酸肽（ＣＰＰ）是牛乳酪蛋白经适合的蛋白酶酶
ＰＥＮＧＷｅｉ，ＬＩＵＬｉ，ＬＩＵＦｅｉ，ＯＵＡｉ－ｆｅｎｇ。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｓｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＰＰ），ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｅｒｅｄｅｉｒｖｅｄｆｒｏｍｃａｓｅｉｎｂｙｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ．
有效促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用，可用于各种营养、保健食品。本研究对不同种类的酶水解牛乳酪蛋白，优选出ＣＰＰ得率最高的ＬＣ一１酶，对其工艺条件进行优化，确定其最佳酶解条件
为：ｐＨ８．０、温度５０ ℃ 、底物浓度１０％、酶解时间２ｈ。通过中试验证，ＣＰＰ含量为２２．３％。关键词：牛乳酪蛋白；酪蛋白磷酸肽；酶解