AFLP标记技术的发展和完善
AFLP分子标记的发展及应用
AFLP分子标记的发展及应用分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,直接体现基因组DNA 间的差异。
在过去30多年,DNA 分子标记得到了迅速发展。
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) 技术为第二代分子标记技术,是在随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 和限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 技术上发展起来的DNA 多态性检测技术,同时拥有RFLP的高重复性和RAPD简便快捷的特点。
同其他以PCR 为基础的标记技术相比,AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记,具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点,自1995年由Zabeau和Vos创建以来,已在动物、植物和微生物的分子系统学研究中得到应用,具有广阔的发展前景。
1 AFLP 标记的基本原理、操作流程及技术关键1.1 AFLP 标记的原理AFLP 标记的原理是对基因组总DNA 酶切后经PCR 进行选择性扩增。
先将基因组DNA 用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段,并与含有粘性末端的人工接头相连,形成酶切位点不同的限制性酶切片段,然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增,预扩增产物作为进一步PCR 扩增的模板,再选用特异引物进行选择性扩增,扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。
由于不同来源DNA 的酶切片段存在差异,因而产生了扩增产物的多态性。
1.2 操作流程AFLP 标记的具体操作流程为: ①DNA 提取和质量检测;②双酶切和酶切片段连接;③酶切连接片段的预扩增;④选择性扩增;⑤扩增产物在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳; ⑥将电泳后的凝胶进行显影检测及数据分析。
遗传标记技术中aflp
遗传标记技术中aflpAFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种遗传标记技术，广泛应用于遗传学研究和种质资源保护。
本文将从AFLP的原理、操作步骤、优势和应用等方面进行介绍。
AFLP是一种基于多态性片段长度的遗传标记技术，它结合了PCR 扩增和限制性内切酶切割的特点。
首先，通过PCR扩增目标DNA 片段，然后利用限制性内切酶对扩增片段进行切割，生成多个DNA 片段。
这些片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离并检测，形成特定的DNA指纹。
通过比较不同个体或群体之间的AFLP指纹图谱，可以揭示出遗传变异的差异。
AFLP的操作步骤相对简单，主要包括DNA提取、PCR扩增、酶切反应、连接DNA适配体、选择性扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
首先，需要从样品中提取高质量的DNA。
随后，利用特定引物对目标DNA进行PCR扩增，产生大量的扩增片段。
接下来，使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切反应，得到多个DNA片段。
这些片段会与连接了适配体的引物结合形成适配体-片段复合物，随后进行选择性扩增，选择性引物将引导特定片段的扩增。
最后，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用荧光染料或放射性同位素进行检测和分析。
AFLP技术具有以下几个优势。
首先，AFLP可以同时检测多个位点的多态性，相比传统的基因标记技术，其检测效率更高。
其次，AFLP技术不需要事先了解目标基因序列，适用于未知基因组的研究。
此外，AFLP可以检测到较低频率的遗传变异，对于研究物种间或个体间的遗传关系非常有用。
最后，AFLP技术具有较高的重复性和稳定性，结果可靠性较高。
AFLP技术在遗传学研究和种质资源保护中得到了广泛应用。
在遗传学研究中，AFLP可以用于揭示物种间或个体间的遗传关系、群体遗传结构的分析以及基因组演化的研究。
在种质资源保护中，AFLP可以用于遗传多样性的评估和遗传资源的鉴定，为保护和合理利用遗传资源提供科学依据。
AFLP分子标记的发展及应用
收稿 日期：０ ０一 ｌ １ ２ １ Ｏ －５ 作者简介 ： 静（ ９９ ） 女， 刘 １ 一 ， 硕士， 师。Ｅ— ａ ：ｕ ｒ９ １ ＠１３ ＣＩ ７ 讲 ｍ ｉ ｌ ｊ￣ ７ ２ ６ ．Ｏ ｌ ｉｉ ｎ
京林业大学学报 ， ０ ０ ２ （ ） ７ — ３ ２０ ，２ ６ ：９ ８ ．
［］ 李 ６
１ ＡＬ Ｆ Ｐ标记 的基本 原 理 、 操作 流程 及 技
术 关键
１ １ Ａ ＩＰ 记的原 理 ． ＦＪ 标
ＡＬ Ｆ Ｐ标记 的原理是对基 因组 总 Ｄ Ａ 酶切 Ｎ
后 经 Ｐ Ｒ进行选 择性扩 增 。先将 基 因组 Ｄ Ａ用 ｃ Ｎ 两 种限制 性 内切 酶 酶 切成 大 小 不 等 的 片段 ， 与 并
不断改进和优化 ， 由此衍生出多种相关技术 ， 并 使其 在遗传多样 性、 种质 鉴定 、 遗传图谱构 建 、 因定位 等研 基 究 中得到广泛的应用。本文 即对 Ａ Ｌ ＦＰ的原理、 衍生技术及其应用等进行了介绍 。
关键词 ： 分子标记技术 ； Ｆ Ｐ 应用 ＡＬ ； 中图分类号 ： ５３ Ｑ ０ 文献标识号 ： Ａ 文章编号 ：０ １ ４４ （００ ０ － ０ ０ ０ １０ － ９ ２ ２ １ ） ５ ０ １ － ５
为第 二代分子标 记技术 ， 是在 随机 扩增 多态性 （ ａ ｄｍ ｍｐｉｅ ｏｙ ｏｐ ｉ Ｄ Ａ，Ｒ Ｐ Ｒ ｎ ｏ Ａ ｌ ｄＰ ｌ ｒｈ Ｎ ｉ ｆ ｍ ｃ Ａ Ｄ）和
限制 性 片 段 长 度 多 态 性 （ ｅｔｃｏ ｒ ｍ ｎ Ｒ ｓｉｉ Ｆａ ｅｔ ｒ ｔｎ ｇ
ｎｔ Ｐｌ ｏ ｈｓ Ｒ Ｌ ）技术上发展起来的 ｇＩ ｏ ｍ ｒ ｉ Ｉ ｙ ｐ ｍ， Ｆ Ｐ Ｄ Ａ多态性检测技术 ， Ｎ 同时拥有 Ｒ Ｌ Ｆ Ｐ的高重复 性和 Ｒ Ｐ Ａ Ｄ简便快捷的特点。同其他 以 Ｐ Ｒ为 Ｃ 基础 的标 记 技 术 相 比 ， Ｆ Ｐ 技术 能 同 时 检 测 到 ＡＬ 大量 的位 点 和多态性 标记 ， 具有覆 盖面广 、 高保 真 性、 高效性、 高分辨率、 Ｎ Ｄ Ａ用量少、 事先勿需 知 道序列任何信息、 可在全基因组产生标记、 标记的 分离遵循孟德 尔遗传 规律等优点 ， １９ 自 ９５年 由 Ｚｂａ Ｖ ｓ ａｅｕ和 ｏｕ 创建以来 ， 已在动物、 植物和微生
aflp指纹图谱技术在动物物种鉴定中的应用
aflp指纹图谱技术在动物物种鉴定中的应用从最早的时候，人们一直以来都在以不同的方式识别动物。
例如，古代的人们会使用剥皮法来鉴别动物，而现代的人们则开始使用更先进的技术来识别动物种类，例如，AFLP指纹图谱技术。
AFLP指纹图谱技术是一种基于酶切和PCR扩增技术，用于获得准确的、特异性的动物物种识别。
该技术首先以质粒DNA作为材料，然后通过不同的酶切，可以将质粒DNA分解为不同的片段，这些片段会形成特定的指纹图谱，从而可以识别出不同的物种。
AFLP技术在动物物种识别中的优势在于它的准确性和快捷性。
它的准确性很高，因为它利用特定的DNA序列来分解DNA，使得每个物种都有自己稳定的特征，可以更准确地识别出不同的物种。
而且，它的快捷性也非常好，这是因为它不需要大量的时间来识别一个物种，同时它也不需要过多的设备，只需要简单的实验室设施就可以完成分析。
另外，它也可以分析小量样本，这一点对于在野外很难抓取的动物尤其有用。
AFLP技术的使用范围也非常广泛，既可以应用于动物种类鉴定，也可以用于繁殖、迁移和淘汰动物的研究工作。
例如，研究人员可以利用这种技术来跟踪某一物种的迁移路径，以便了解动物的分布以及繁殖模式，这对于动物管理和保护也有很大的意义。
AFLP技术在动物物种鉴定领域发挥了重要作用，它提供了一种更加精准、快捷的动物识别方式，让人们可以更快更准确地识别出动物的种类。
但是，它也有一些缺点，例如，由于物种的遗传变异，在鉴定物种的过程中，可能会出现误差。
另外，AFLP技术也需要花费更多的时间和金钱来进行，因此在实际应用中，也需要慎重考虑这些问题，以便使用AFLP技术来有效地鉴定动物的物种。
总之，AFLP技术是一种非常有用的物种鉴定技术，它可以有效地鉴定出不同物种的动物，让人们可以更准确地了解不同物种的分布与繁殖模式，而且这项技术的使用范围也非常广泛，可以应用于动物物种鉴定以及动物管理和保护方面的研究工作。
因此，未来AFLP技术在动物物种鉴定中的应用仍然会得到进一步的推广和发展。
AFLP标记技术的发展和完善
而建立的 ， 该方法首先采用单一限制性内切酶如 接着 !"# ! 消化基因组 "#$ 或 !"#$ 并连接接头， 用无选择性碱基引物进行扩增， 产生了没有甲基化 扩增产物再经对甲基化敏感的内切 , 残基的模板， 酶如 $"% !进行二次消化， 然后接相应接头， 接着用 带有选 择 性 碱 基 的 标 准 $&’( 引 物 进 行 第 二 次 扩 增， 其产生的带型与标准 $&’( 所产生的带型进行 比较， 原来在 $"% ! 位点包含有甲基化的 , 残基经 过初始的无选择性碱基引物扩增后可以被 $"% ! 二 次消化， 而标准 $&’( 的原始模板在 $"% ! 位点被甲 基化了的 , 残基则不能被 $"% !消化。 !"+ — —三限制性酶切 ’()* ,-&’()*— ［ ］ -.*$&’( 是 /01 234 56477 #% &’ 8 报道的一种基
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AFLP分子标记技术的发展
文章编号:100021336(2003)0120065203AFLP 分子标记技术的发展郑先云 郭亚平 马恩波(山西大学生命科学与技术学院,太原030006)摘要:AFL P 分子标记技术是一种建立在PCR 技术和RFL P 标记基础上的新的DNA 指纹分析技术,具有多态性丰富、结果稳定可靠、重复性好、所需DNA 量少,且可以在不知道基因组序列的情况下进行研究等特点,现已被广泛用于构建遗传图谱、遗传多样性研究、系统进化及分类学、遗传育种和品质鉴定以及基因定位等方面。
介绍AFL P 技术的原理以及AFL P 技术基础上条件的改进。
关键词:分子遗传标记;AFL P ;条件优化中图分类号:Q7收稿日期:2002209229国家自然科学基金(No.30170612)和山西省自然科学基金项目(No.991096)资助作者简介:郑先云(1974—),女,博士生;马恩波(1953—),女,博士生导师,教授,本文联系作者。
扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism ,AFL P )是一种基于PCR 和RFL P 基础上发明的DNA 指纹技术。
该技术与RFL P 的主要区别是用PCR 代替Southern 杂交,它兼有RFL P 技术的可靠性和PCR 技术的高效性,且具有快速、灵敏、稳定、所需DNA 量少、多态性检出率高、重复性好、可以在不知道基因组序列特点的情况下进行研究等特点,所以被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标记,现已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。
1.AFLP 技术的原理AFL P 技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
由于不同物种的基因组DNA 大小不同,基因组DNA 经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。
使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA 进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。
苹果性状标记AFLP技术体系的建立和优化
（．山东农业 大学 园艺科学 与工程学院 ． １ 山东 泰安 ２ １ １ ｌ ． 岛市农业科学研究院 ． ７０ ８ 青 ２ 山东 青岛 ２６２； ６ ０ １
３ ．中 国科 学 院遗 传 与 发 育生 物 学 研 究 所 ． 北京 １０ ０ ） ０ １ １
摘 要 ： 舞姿” 以“ 苹果与平 邑甜茶的杂交后代个体 为试 材． 结合工作实践及 当前最新 研究进展 ． ＡＦ Ｐ 对 Ｌ
分析过程 中模板 Ｄ ＮＡ的制备 、 因组 Ｄ 基 ＮＡ 的酶切与连接 、 酶切连接产物 的预扩增 与选 择性扩 增 、 扩增 产物
的变性 、 聚丙烯酰胺凝胶 电泳等过程 中易 出现的问题及其解决方法作 了对 比研究 ． 立了一套适合 于标记苹 建
AFLP的原理及其应用
基础理论 B asic researchA FL P的原理及其应用王 斌 翁曼丽(中国科学院遗传研究所 100101)提 要:A FL P是检测DNA多态性的一种新的分子标记技术。
对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。
关键词:分子标记技术 A FL P 原理 应用1 分子标记技术的快速发展在过去10a中,分子标记技术得到了突飞猛进的发展,至今已有10余种分子标记技术相继出现,并在各个研究领域得到了应用。
其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是R FL P和RA PD。
R FL P 的结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图,例如水稻R FL P连锁图的建立〔1,2〕。
R FL P比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中,R FL P标记在染色体上的排列具有类似的顺序〔3,4〕。
因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a了,但它仍是当今应用最广泛的一种分子标记。
然而,R FL P必须经过滤膜转移和Sou thern杂交,费时、费力、周期长。
另外, R FL P对DNA多态性检出的灵敏度不高,R FL P连锁图上还有很多大的空间区,这限制了它的进一步发展。
PCR对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用,迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型,其实除了以传统的Sou thern杂交为基础的R FL P外,其它各类分子标记都涉及PCR。
RA PD就是以随机引物为模板通过PCR扩增进行DNA多态性研究的,与R FL P相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DNA用量少,而且不需要同位素,安全性好。
继R FL P之后,RA PD是应用最广泛的,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RA PD标记。
近来西红柿P to基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD标记,然后通过M BC(M ap based clon ing)方法克隆了目的基因〔5,6〕。
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22卷5期2006年9月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.22 N o.5September 2006Received :M arch 31,2006;Accepted :M ay 12,2006.3C orresponding author.T el :86251427972168;E 2mail :yzulitao @AFLP 标记技术的发展和完善The Advancement of AFLP Technology李 韬LI T ao教育部植物功能基因组学重点实验室,江苏省作物遗传生理重点实验室,扬州大学 扬州 225009K ey Laboratory o f Plant Functional G enomics ,Ministry o f Education ;Jiangsu Provincial K ey Lab o f Crop G enetics and Physiology ,Yangzhou Univer sity ,Yangzhou225009,China摘 要 AF LP 标记技术自诞生以来,由于集成高效性、高通量、无需知道序列信息等诸多优点而在分子生物学研究中得以广泛应用。
近年来,研究人员对该技术进行了不断的优化和完善,并由之衍生出多种相关技术,不仅能区分纯合子和杂合子,还能够将感兴趣AF LP 条带进行位点特异性标记的高效转化,从而有利于进行大规模单位点检测和基因克隆,检测技术更趋高效。
重点评述近年来“常规”AF LP 技术向更高通量、更加高效和信息完全AF LP 技术的转化和发展,了解这些变革对高效利用AF LP 技术实现研究目标具有重要的意义。
关键词 AF LP ,衍生技术,进展和完善中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号100023061(2006)0520861205Abstract AF LP technology has been w idely used in m olecular biology due to its integration of several advantages of high throughput ,high efficiency and requiring no sequence in formation ,etc.G reat changes have been achieved in recent years in AF LP 2related technologies and platforms.There are several AF LP 2expanded technologies available.These im proved technologies are capable of distinguishing the heterozyg ote from the hom ozyg ote and of converting any AF LP band of interest ,w ithout much effort ,into locus 2specific markers ,which can be deployed for massive locus detection and for gene isolation.This review focuses on these fav orable changes from conventional AF LP technology into m ore effective and m ore practicable AF LP 2related ones.Understanding these advancements and AF LP 2expanded technologies w ill facilitate the achievement of our research g oals.K ey w ords AF LP ,AF LP 2expanded technologies ,advancements AF LP (Am plified Fragment Length P olym orphism ,AF LP )标记技术自V os et al [1]发明以来,由于具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、所需DNA 量少、事先毋需知道序列的任何信息、可在全基因组产生标记、其标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点,已被广泛用于生物多样性研究、种属特异性鉴定、分类和进化研究、构建遗传连锁图谱和物理图谱、轮回育种的背景选择、研究基因表达与调控、基因克隆、甲基化研究、单核苷酸多态性(S NP )发掘以及转座子研究等方面。
但是AF LP 标记技术也有局限性,自诞生后技术本身也在不断的发展和完善,并由之衍生出许多相关技术。
因此本文将重点述评AF LP 标记技术的发展和完善,为研究人员高效利用该技术实现研究目标提供一定的参考。
1 AFLP 的几种衍生技术111 SADF 2AF LP ———单限制性酶切AF LP其基本原理是,采用单限制性酶对基因组DNA或cDNA进行消化,而非常规的双酶切,并且使酶切和连接在同一反应体系中进行,选择性扩增产物在琼脂糖凝胶电泳后即可进行分离检测[2]。
对于基因组相对简单的生物,利用单限制性酶切AF LP快速而且重复性好,但对于基因组复杂的生物,由于琼脂糖胶的分辨率较低,往往受到一定的限制。
112 SD2AF LP———二次消化AF LPS D2AF LP起初是为了甲基化状态的遗传稳定性而建立的[3],该方法首先采用单一限制性内切酶如MseⅠ消化基因组DNA或cDNA并连接接头,接着用无选择性碱基引物进行扩增,产生了没有甲基化C残基的模板,扩增产物再经对甲基化敏感的内切酶如P stⅠ进行二次消化,然后接相应接头,接着用带有选择性碱基的标准AF LP引物进行第二次扩增,其产生的带型与标准AF LP所产生的带型进行比较,原来在P stⅠ位点包含有甲基化的C残基经过初始的无选择性碱基引物扩增后可以被P stⅠ二次消化,而标准AF LP的原始模板在P stⅠ位点被甲基化了的C残基则不能被P stⅠ消化。
113 TE2AF LP———三限制性酶切AF LPTE2AF LP是van der Wurff et al[4]报道的一种基于AF LP技术一种新的指纹技术。
其基本原理是用三种限制性内切酶切割基因组DNA,一种多切点酶,两种稀有切点酶,因此叫做TE2AF LP(three endonuclease AF LP)。
该技术应用三种限制性内切酶和两组接头在单一的缓冲体系中对基因组DNA酶切和连接来研究DNA片段多态性。
这种方法与传统的双酶切AF LP技术相比由于多了一个酶切位点,其分辨效力增加了,而扩增的总带数反而减少,比常规AF LP带数减少大约20%左右。
由于该方法采用了酶切连接同步进行和一步PCR反应,省去了预扩增步骤,使得分析速度和成本都低于常规的AF LP分析方法,特别适用于复杂基因组的分析,操作简单、省时。
114 Substracted AF LP———差减AF LP为解决AF LP中样品间共同片段对多态性片段识别的干扰,Chai J2F et al[5]将差减抑制杂交原理[6]和AF LP标记技术[1]相结合,建立了一种“减法AF LP 标记技术”,基本原理是将T ester DNA和Driver DNA 分别双酶切并和接头连接,进行预扩增,将预扩产物纯化后作模板,再行酶切连接,然后进行两轮差减抑制杂交,再将差异片段纯化后进行预扩和选扩。
他们运用该技术对小麦中的外源染色体片段进行了标记。
该法的优点是能够显著减少样品间的共同扩增片段,在非变性聚丙稀酰胺凝胶上带型差异明显,多态性片段容易分辨,但该方法也存在明显的缺点,其操作步骤非常繁琐、流程长且成本高。
115 Microsatellite2AF LP———微卫星AF LP Microsatellite AF LP,又称S AMP L(selective am plification of microsatellite polym orphic DNA),这是将RAMP(randomly am plified microsatellite polym orphism)微卫型引物和选择性AF LP随机引物相结合的一种指纹技术,能够扩增含有简单序列重复域(SSR)的限制性片段,产生高频率的共显性标记,该技术整合了SSR标记共显性和AF LP标记带型丰富的特点,能够揭示更多的遗传信息,可靠性高、假阳性较低[7,8]。
RAMP引物由5′端铆钉序列和3′端重复域序列构成,而扩增区段是RAMP引物结合区和选择性扩增AF LP引物结合区之间的序列。
产生的指纹因AF LP选择性碱基组成、RAMP引物的5′端铆钉序列和3′端重复域序列的不同有所差异。
该技术也无需事先知道序列信息就能够扩增简单序列重复域,进一步丰富了AF LP指纹技术,可以对目标生物快速的进行常规的分子检测,因此也是一种值得尝试的强有力作图工具。
116 cDNA2AF LP———互补DNA2AF LPBachem et al[9]将AF LP技术应用于mRNA表达差异分析,发展了一种mRNA指纹图谱技术,即cDNA2AF LP技术。
基本原理是将分离纯化的mRNA 反转录成cDNA第一链,再以第一链为模板合成双链cDNA,然后以此双链cDNA为模板进行酶切连接、预扩和选扩,最后找到差异表达的片段。
该技术保留了AF LP技术的可靠性与高效性,可广泛地应用于植物生长发育过程基因分离与表达特性的研究。
该法比较灵敏和可靠,不需要知道基因或EST 的任何序列信息,一次能够分析大量差异表达的基因,并能够检测出低丰度表达的转录本。
自从其诞生以来,许多研究者将此法用于基因的差异表达谱分析以及差异表达基因的克隆。
但该法的主要局限性在于不易分离到全长序列。
2 相对低通量和信息不完全AFLP技术向高通量、信息完全技术的转化211 由同位素标记、生物素标记技术、银染技术向荧光标记技术的转化同位素标记(通常是32P或33P)技术比较灵敏,相当一部分实验室仍采用同位素标记,其最大的缺点就是具有放射性。
由于同位素的不安全因素,现268Chinese Journal o f Biotechnology 生物工程学报 2006,V ol122,N o15在部分实验室采用生物素标记(如地高辛)代替同位素标记,其灵敏性略低于或相当于同位素,其优点是没有放射性,对人体不会造成伤害,但采用生物素标记流程较长,步骤比同位素标记繁琐,而且成本也高。