中国药品检验标准操作规程2010版细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法

1 简述

1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有

争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.2 供试品细菌内毒素限值的确定

1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；

1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：

L＝K∕M

式中

L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。

K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。

药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。

1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定

供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：

MVD＝C·L／λ

L为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于 1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ml。

λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。

供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。

1.4 药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检

验中出现干扰的情况需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研

究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。

2 实验材料及用具

2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。

2.2 电热干燥箱用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃。

2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。

2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。

2.5 旋涡混合器。

2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。

2.7 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制

品检定所统一发放的标准品。

2.8 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU／ml（用于凝胶法）或0.005EU／ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

2.9 实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75％乙醇棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且

对试验无干扰的器械。

2.10 细菌内毒素光度测定仪器。

3 实验准备

3.1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取

出将洗液控干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，控干后放入适宜的密闭

金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入电热干燥箱。

3.2 玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待干

燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，

在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

3.3 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般

要求供试品溶液的pH值在 6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被

测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内

毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

4 凝胶法操作方法

4.1 鲎试剂灵敏度复核

鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正

确及试验条件是否符合规定。

因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须

进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.1 实验操作

4.1.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部

轻轻划痕，75％乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落人瓶内。

按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋

涡混合器上混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程

请参见标准品使用说明书）。

若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细

菌内毒素工作标准品，为一次性使用。

4.1.1.2 待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1ml／支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物

充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml／支时，取|若干支按其标示量加入检查用

水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1分装到10m m×75mm凝集管中，要求至少分

装18支管备用。

4.1.1.3 加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。

4.1.1.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入

37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min＋2min。

4.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（十）；未形成凝胶或形成的凝

胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴

性结果。

4.1.2 实验结果计算

当最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，

按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）