血凝试验
血凝试验原理及临床应用
血凝试验原理及临床应用血凝试验是一种常用的临床实验室检测方法，用于评估血液凝血功能。
它通过模拟体外环境，测量血液在凝血过程中产生的凝块形成时间及强度，以评估凝血功能的正常与异常。
血液凝固是一种复杂的生物反应过程，涉及多种血液凝血因子、调节因子以及血小板的相互作用。
血凝试验主要包括凝血酶时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和凝血因子活性测定等。
凝血酶时间（PT）是评估外源凝血途径功能的指标，主要用于监测肝功能和维生素K缺乏。
在凝血酶时间测定中，将血浆与外源凝血途径所需的磷脂、磷脂酰胆碱和凝血酶原混合，通过开始凝块的时间来评估凝血功能。
凝血酶时间延长可能表示凝血因子缺乏或功能异常。
活化部分凝血活酶时间（APTT）主要用于评估内源凝血途径功能。
血浆与活化剂（如激活的部分凝血活酶或磷脂胶球）混合，然后加入凝血酶原，通过测量开始凝块的时间来评估凝血功能。
APTT延长可能表示凝血因子缺乏或功能异常。
血小板计数用于评估血小板的数量和功能。
血小板是血液中的细小细胞片段，对止血过程至关重要。
血小板计数可以通过血液采样后计算血液中血小板的数量来确定。
异常的血小板计数可能导致出血或血栓形成问题。
凝血因子活性测定用于评估血浆中凝血因子的功能状况。
凝血因子的异常活性可能导致凝血功能的紊乱。
凝血因子活性测定可以通过血浆中凝血因子的活性水平来确定。
血凝试验的临床应用主要包括：评估凝血功能异常的原因、监测抗凝治疗的疗效、评估血液凝块病和血友病等遗传性凝血障碍、评估出血和血栓风险。
对于评估凝血功能异常的原因，血凝试验可以帮助确定是由于凝血因子缺乏、功能异常还是其他原因导致的凝血功能紊乱。
这对于明确病因和指导治疗具有重要意义。
同时，在抗凝治疗过程中，血凝试验可用于监测抗凝药物的疗效。
例如，PT值可以用来监测华法林等维生素K拮抗剂的抗凝效果。
APTT值可以用来监测肝素、低分子量肝素和直接口服抗凝药物（例如阿司匹林和卡哇地洛）的抗凝效果。
血凝实验步骤
4单位抗原
物品准备
病毒抗原、PBS缓冲液、1%鸡红 细胞、单道和多道移液器及吸头 、20ml青瓶及塞子、96孔微量血
凝板。
测定病毒滴度
血凝法确定病毒滴度为2的8次方， 根据此滴度计算四单位病毒的稀释 倍数，即64倍稀释。
抗原配制
取19.7ml缓冲液加入20ml小青瓶中 ，再加入0.312ml病毒抗原液，充 分混匀，四单位抗原即完成配制。
小心地吸去上层的白细胞血浆等，并记录离 心管中的液体体积。注意保留最后一滴液体 ，因为这可能是红细胞液。
血凝
物品准备
待检测的样品、1%鸡红细胞、96孔血凝板、移液器及吸头、 恒温箱。
试验步骤
用PBS（生理盐水）铺板。倍比稀释：依次加入待检样品， 吹打后吸出并弃去。加红细胞：每孔加50微升1%红细胞，置 于37℃温箱或室温反应20-40分钟。读数：出现完全凝集的 孔作为病毒的血凝滴度。
抗原原液*稀释倍数=所需抗原体积。
计算需要PBS缓冲液的体积，可利用公式
抗原原液*稀释倍数=所需PBS缓冲液体积。
04
血凝实验应用与局限
Chapter
应用领域
01 02
医学
在医学上，血凝实验通常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。例如， 检测流感病毒、艾滋病病毒等。此外，血凝实验还可以用于检测细菌毒 素，如破伤风毒素等。
离心管操作
03
将抗凝血和PBS或生理盐水混合，轻轻颠倒混匀，以获得均衡的
血液稀释。
1%红细胞准备
第一次离心
第二次离心
盖上离心管盖，放入低速离心机中，设定 转速为1500rpm，5分钟。
取出离心机，小心地吸去上层的白细胞血 浆等，并记录离心管中的液体体积。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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病毒的血凝试验名词解释
病毒的血凝试验名词解释病毒的血凝试验是一种常见的检测方法，用于确定病毒感染的存在以及病毒类型的鉴定。
该试验利用了人体免疫系统对病毒的免疫反应，通过检测血浆中的凝集反应来判断病毒感染的有无。
本文将对与病毒的血凝试验相关的一些术语进行解释。
1. 血凝试验（Hemagglutination）：血凝试验是一种常用的免疫学方法，通过观察红细胞的凝集反应来判断病毒的存在。
在病毒感染的情况下，病毒可以使得红细胞发生凝集现象，从而形成一种网状结构。
这种凝集反应可以帮助医生确定病毒感染的类型和程度。
2. 血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition Assay）：血凝抑制试验是一种用于确定病毒感染的抗体的存在与否以及抗体的效力的方法。
在这个试验中，医生将不同浓度的病毒抗原加入患者血浆样本中，观察其中是否出现了病毒凝集反应。
如果患者的血浆中存在与病毒抗原相结合的特异性抗体，那么这些抗体会与病毒抗原结合，并阻止病毒与红细胞产生凝集反应。
通过检测凝集反应的程度，可以评估患者血浆中的抗体效力及抗体的浓度。
3. 血凝试验凝集效价（Hemagglutination Titer）：血凝试验凝集效价是用来表示血浆中抗体浓度的方法。
凝集效价通常以最高稀释度的倒数来表示，也就是需要将血浆稀释到什么程度才能抑制病毒凝集。
凝集效价越高，表示血浆中的抗体浓度越高，对病毒的抵抗能力也就越强。
4. 血凝图谱（Hemagglutination Curve）：血凝图谱是在血凝试验中绘制的一种图形，用于表示血浆稀释度与血凝反应之间的关系。
血凝图谱的横轴通常表示血浆的稀释度，纵轴表示血浆与病毒的凝集反应的程度。
通过绘制血凝图谱，可以评估不同血浆样本的抗体效力以及浓度的分布情况。
这样的图形有助于医生判断病毒感染的程度，病程的演变以及抗体的持续时间等信息。
血凝试验作为病毒感染的常用检测方法，在临床医学中扮演着重要的角色。
通过观察红细胞的凝集反应，医生可以准确判断患者是否感染了病毒，并进一步确定病毒的类型。
试述血凝试验的操作步骤
试述血凝试验的操作步骤
血凝试验是一种常用的临床试验，用于评估血液凝固功能。
下面是血凝试验的一般操作步骤：
1. 收集标本：使用细长的无菌针从患者的静脉或指尖取得血液标本。
通常需要抽取约5ml的血液。
2. 采样管处理：将采样的血液标本转移到无菌采样管中，并轻轻倒置搅拌混合，确保血液和抗凝剂彻底混合。
3. 样本准备：用无菌塑料移液器将混合好的血液标本转移到一个无菌的试管中。
4. 血管外皮细胞分离：用适量的无菌生理盐水稀释血液样本，然后进行离心，将血浆与血细胞分离。
抛弃上清液，保留血细胞沉淀。
5. 血小板去除：用适量的凝血因子激活，将其加入待测的血细胞沉淀中，然后进行轻轻搅拌，使血小板聚集在一起。
6. 凝集剂处理：将适量的含有凝集剂的溶液加入血细胞沉淀中，并轻轻搅拌，直到血凝聚集。
7. 时间记录：根据试验要求，等待一定时间（通常为5-10分钟），观察血液的凝固现象并记录凝固时间。
8. 结果解读：根据实验结果，判断血凝试验的结果是否正常。
正常情况下，血液会在规定的时间内凝固，若出现异常，则可能存在凝血功能障碍。
需要注意的是，血凝试验的具体操作步骤可能因具体试剂和仪器的不同而略有差异，因此在进行血凝试验时应按照试剂和仪器的说明书进行操作。
同时，为了确保结果的准确性，操作人员应具备相关的实验室技能和操作经验，同时遵守严格的无菌操作规范。
血凝HA和血凝抑制试验课件
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3. 热灭活法
3.1鸡血清
取100µL血清样品放入一灭菌离心管中；
各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭 菌离心管中；
56℃水浴30min。
3.2 其它禽类血清
血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、 阳性血清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水 浴30min。
4000转离心1min；
取出上清，进行HI试验；
用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性
用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
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2.RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注
意避免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用
三、实验步骤 （以禽流感为例, 参照禽流感防治 技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化
钠0.42g, 加蒸馏水至100mL, 散热溶解后调pH值至6.1, 69kPa 15min高压灭菌, 4℃保存备用。
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•2 1%鸡红细胞液的制备
Hale Waihona Puke 全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高
稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位
血凝试验原理
血凝试验原理血凝试验是一种常用的临床检查方法，常用于评估患者的凝血功能情况。
该试验基于血液凝固系统的生物化学原理，通过测定血液中特定指标的变化，以反映该系统的功能状态。
血液凝固系统包括凝血因子、纤维蛋白原、纤维蛋白和加压素等多个生物分子，通过一系列复杂的化学反应，促进凝血过程的进行。
当血管受到伤害时，破裂的血管壁会释放凝血因子，启动凝血过程。
在血液凝固过程中，凝血因子的激活和相互作用产生血小板聚集作用并转化纤维蛋白原。
经过几个不同反应阶段，最终生成纤维蛋白，使血液凝固并形成血块，以止血。
血凝试验包括多种方法，每一种方法都有不同的原理和适用范围。
以下是三种常见的血凝试验原理：1.凝血时间（PT）试验：凝血时间试验是测定血液中凝血酶原及其活性的一种方法。
医学上常用的是Prothrombin时间（PT）试验，也称Quick试验。
1）原理：将钠离子添加到未凝固的血液样品中，以激活凝血酶的产生和生物反应，然后加入凝血酶原激活剂，协助凝血酶原转化为凝血酶。
该活酶可以促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，以启动凝血反应。
测量样品中笔直凝血时间，反应时限为10至14秒。
2）应用：主要用于评估患者的肝脏以及外科操作的风险。
活化部分凝血时间试验被广泛用于评估凝血因子失衡。
1）原理：在未凝固的血液样品中添加磷脂质以及奎宁铵活化因子，然后测定活化部分凝血时间。
在这个过程中，与凝血因子的相互作用产生反应，导致凝血时间的延长。
2）应用：该试验用于筛查自身免疫性疾病、抗凝治疗以及肝病等患者。
3.纤维蛋白原（Fbg）试验：纤维蛋白原是一种由肝脏产生并在血液中循环的蛋白质，在凝血过程中扮演着重要角色。
检测纤维蛋白原水平可以帮助评估患者的凝血功能。
1）原理：该试验使用离心技术把血液离心并获得血清，测量其中纤维蛋白原等多种蛋白的浓度。
2）应用：该试验可用于评估血液凝血功能异常或血栓形成的风险。
总的来说，血凝试验原理涉及多个生化过程和指标的测量，常常需要结合不同试验方法使用，以获得全面准确的评估。
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，用于评估体内凝血系统的功能状态。
血凝试验原理：
血凝试验通常采用活化部分凝血时间（APTT）或凝血酶时间（TT）来衡量血液凝血的能力。
在血凝试验中，通过向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体（如凝血酶），观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
正常血液凝固功能良好的人，凝血时间较短，血浆在凝血酶原激活体的作用下能很快形成凝块。
血凝抑制试验原理：
血凝抑制试验是为了检测某些抗凝物质（如抗凝血酶、抗凝血酶原等）对凝血系统的抑制作用。
在血凝抑制试验中，首先向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体，观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
然后再加入待测的血凝抑制物质，在不同浓度下观察凝血时间的变化。
如果抗凝物质的浓度越高，凝血时间延长的程度越大，则说明该抗凝物质对凝血系统的抑制作用越强。
血凝与血凝抑制试验的原理即通过衡量血浆的凝血时间来评估凝血系统的功能状态或抑制物质的抑制能力。
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血凝试验(HA)
定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)
血凝抑制试验(HI)
定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HI) 。
原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定
根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。
因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。
病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。
如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用
1%鸡红细胞液的制备
2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL 阿氏液的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀。
2.4 1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS，混合均匀即可。
抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）
3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。
3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。
3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍
稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴头。
3.4每孔再加入25μL PBS。
3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。
对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。
结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾斜（45度左右），观察血凝板，判读结果：
++++：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集
＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈
＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块
＋：红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块
－：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集
能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。
注意！对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效
血凝抑制试验（HI试验微量法）
4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。
以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。
例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。
4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS。
4.3 吸取25μL血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。
4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL，室温（约20℃）静置至少30min。
4.5 每孔加入25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。
4.6 结果判定
以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。
HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。