病毒的血凝及血凝抑制试验
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
25
25
1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
病毒的血凝试验名词解释
病毒的血凝试验名词解释病毒的血凝试验是一种常见的检测方法，用于确定病毒感染的存在以及病毒类型的鉴定。
该试验利用了人体免疫系统对病毒的免疫反应，通过检测血浆中的凝集反应来判断病毒感染的有无。
本文将对与病毒的血凝试验相关的一些术语进行解释。
1. 血凝试验（Hemagglutination）：血凝试验是一种常用的免疫学方法，通过观察红细胞的凝集反应来判断病毒的存在。
在病毒感染的情况下，病毒可以使得红细胞发生凝集现象，从而形成一种网状结构。
这种凝集反应可以帮助医生确定病毒感染的类型和程度。
2. 血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition Assay）：血凝抑制试验是一种用于确定病毒感染的抗体的存在与否以及抗体的效力的方法。
在这个试验中，医生将不同浓度的病毒抗原加入患者血浆样本中，观察其中是否出现了病毒凝集反应。
如果患者的血浆中存在与病毒抗原相结合的特异性抗体，那么这些抗体会与病毒抗原结合，并阻止病毒与红细胞产生凝集反应。
通过检测凝集反应的程度，可以评估患者血浆中的抗体效力及抗体的浓度。
3. 血凝试验凝集效价（Hemagglutination Titer）：血凝试验凝集效价是用来表示血浆中抗体浓度的方法。
凝集效价通常以最高稀释度的倒数来表示，也就是需要将血浆稀释到什么程度才能抑制病毒凝集。
凝集效价越高，表示血浆中的抗体浓度越高，对病毒的抵抗能力也就越强。
4. 血凝图谱（Hemagglutination Curve）：血凝图谱是在血凝试验中绘制的一种图形，用于表示血浆稀释度与血凝反应之间的关系。
血凝图谱的横轴通常表示血浆的稀释度，纵轴表示血浆与病毒的凝集反应的程度。
通过绘制血凝图谱，可以评估不同血浆样本的抗体效力以及浓度的分布情况。
这样的图形有助于医生判断病毒感染的程度，病程的演变以及抗体的持续时间等信息。
血凝试验作为病毒感染的常用检测方法，在临床医学中扮演着重要的角色。
通过观察红细胞的凝集反应，医生可以准确判断患者是否感染了病毒，并进一步确定病毒的类型。
实训九 病毒的血凝及血凝抑制试
实训九病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。
仪器及材料pH7.2、0.01mol/L PBS或生理盐水、1％鸡红细胞悬液、新城疫病毒液、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（V型96孔）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤（一）病毒的血凝（HA）试验（实验视频六）（实图9-1）1．1％鸡红细胞悬液的制备采成年健康鸡血，加入有抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）的离心管中，用20倍量pH7.2、0.01mol/L PBS磷酸缓冲盐水洗涤3～4次，每次以2000r/min离心3～4min，最后一次5min。
每次离心后弃去上清液，并彻底去除白细胞，最后用PBS稀释成1％红细胞悬液。
2．操作术式（实表2）（1）用微量移液器向反应板每孔分别加PBS 50μl。
（2）换一吸头吸取50μl病毒液，加于第1孔的PBS中，并用移液器挤压3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔,混匀后取50μl移入第3孔,依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。
第12孔不加病毒抗原，作对照。
（3）换一吸头吸取1％红细胞悬液依次加入1～12个孔中，每孔加50μl。
（4）加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡1min，并放室温（18～20℃）下作用30～40min，或置37℃恒温培养箱中作用15～30min取出，观察并判定结果。
3．结果判定及记录“＋”表示红细胞完全凝集。
红细胞凝集后完全沉于反应孔底层，呈颗粒状，边缘不整或锯齿状，而上层液体中无悬浮的红细胞。
“－”表示红细胞未凝集。
反应孔底部的红细胞没有凝集成一层，而是全部沉淀成小圆点，位于小孔最底端，边缘水平。
“±”表示部分凝集。
红细胞下沉情况介于“＋”与“－”之间。
新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞，但随着病毒液被稀释，其凝集红细胞的作用逐渐变弱。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
血凝与血凝抑制试验(附思考题及答案)
五、结果判定
• 血凝试验：根据血凝价稀释病毒悬液 • 血凝抑制试验：血凝抑制试验效价：出现完全血凝抑制时的最高
血清稀释度。
Байду номын сангаас
六、思考题
• 1、血凝价判定偏高或者偏低对血凝抑制价的判定结果有什么 影响？
• 若血凝价判定偏高，即稀释的倍数偏高，使得病毒浓度未达 到要求的4个血凝单位，则需要中和病毒的血清更少，即血清 的稀释倍数更大，因此结果会偏高。
将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液备 用 • 0·85%生理盐水 • 鸡血清
四、实验步骤
• （一）血凝试验 • 1～12孔加入生理盐水 • 第一孔加入50ul病毒悬液，倍比稀释至第11孔 • 1～12孔加入1%的红细胞50ul • 震荡后置于37度恒温箱25～30min后，观察结果 • 病毒的血凝价？ • 病毒的血凝价：能使红细胞产生50%凝集的病毒最高稀释度。
血凝和血凝抑制试验
安尧o
一、实验目的
• 1、掌握病毒血凝与血凝抑制试验的原理。 • 2、掌握试验的设计、操作步骤和结果的判定。
二、实验原理
• 血凝试验（HA）：
• 血凝抑制试验（HI）：
• 某些病毒能够使动物的红细胞发 生凝集现象。
• 红细胞凝集的本质是抗原-抗体 反应，红细胞表面存在凝集原
• 在病毒悬液中加入特异性抗体
• 2、血凝和血凝抑制试验的应用？ • 血凝试验可以检测某种病毒是否具有凝集红细胞的能力，测
定病毒的血凝价、滴度，血凝抑制试验可以检测抗体是否有 效，抗体的效价。
请在此处添加标题
• （二）血凝抑制试验 • 1～11孔加入25ul生理盐水 • 第1孔加待检血清25ul，倍比稀释至第10孔 • 1～11孔加入25ul4个血凝单位的病毒悬液 • 1～12孔加入1%红细胞50ul • 震荡后置37度恒温箱25~30min观察结果。 • 红细胞凝集100%的抑制作为结果判定的终点
试验四血凝及血凝抑制试验
血凝现象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,鸡,豚鼠等动物RBC。
原理：血凝素与RBC表面相应受体结合，引起RBC凝集；
用途：①滴定病毒的血凝效价，为血凝抑制试验做准备；
②确定病毒的存在；
凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，
即0.25 ml病毒液含1个血凝单位。在病毒血凝抑制试验中，一般用4个血 凝单位。
(1:64) 0.25
(1:128) (1:256) 0.25 0.25 0.25
0.5%RBC 0.25
(negative control) mix, RT, 45min~1hr，observation
血凝抑制试验
血凝抑制现象： 血凝素抗体使病毒失去凝集红细胞能力的现象。作
为临床检测试验，可用于检测血清中抗体含量或鉴 定病毒。称为血凝抑制试验。
(1:160) 0.25 0.5
(1:320) (1:10) 0.25 0.5 0.25(NS) 0.5 (Serum control)
V(4U)
0.25
0.5%RBC 0.5
Mix, RT, 1hr, observation
RBC凝集状态的解释
++++: agglutination of all RBC +++: agglutination of about 75% RBC
具体方法：
Tube
NS 血清 弃 0.25ml
1
0.45 0.05 (1:10)
2
3
4
5
6
7
0.45 0.05
↘
0.25 0.25
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
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病毒的血凝及血凝抑制试验
有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL）
弃50
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行
结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不
凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1
看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分
别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11
孔各加50μL生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50μL，吹吸混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀
释至第10孔，吸弃50μL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城
疫阳性血清50μL，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50μL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50μL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：μL）
6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。
凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
附录
1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
枸橼酸钠（5H2O）0.80g
枸橼酸（H2O）0.055g
葡萄糖 2.05g
氯化钠0.42g
双蒸水加至100 ml
将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。
2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。
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