氯化钙法制备感受态
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
感受态细胞的制备(氯化钙法)
感受态细胞的制备（氯化钙法）
（1）将-80℃保存的甘油管E. coli DH5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒放于37℃恒温培养箱中，过夜培养12-16 h；
（2）从平板上挑取单菌落接种于5 ml液体LB试管培养基中，37℃振荡培养过夜；
（3）按1%-5%的比例将种子菌液接种于100 ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6-0.9（一般按照2%的接种量培养3 h即可）后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；
（4）将菌液转入50 ml离心管中，在冰上放置10 min，于4℃低温离心机以6000 rpm/min 的速度离心10 min，收集菌体；
（5）弃上清，加入1/10体积（10 ml）预冷的感受态制备液buffer 1，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中切忌用力过大以免破坏菌体细胞，冰浴10 min；
（6）冰浴后再次于4℃低温离心机中以6000 rpm/min离心10 min，弃上清后在冰上加入2 ml 预冷的感受态制备液buffer 2重悬菌体，最后将细胞按100 ul/cell分装，取100 μl制备进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置于-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
感受态制备
氯化钙法制备JM109感受态细胞（屡试不爽，研究生亲身经历）
从超低温冰箱取甘油种，平板划线活化过夜
1. 从平板上挑取单菌落洗入3ml 的LB培养基，37度摇菌过夜
2. 按1%的量接种50ml 的LB培养基，摇菌到对数中期，2.5-3 h，此时培养基中的细菌呈云雾状，状态是最好的，或者OD值0.4-0.6
3. 将细菌分别转移到两个已灭菌的，已预冷的50 ml的圆底离心管中，冰浴10min，使菌液冷却至0℃
4. 收菌，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
5. 每50ml的初始培养物用30ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
6. 每50ml的初始培养物用2ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，记住用枪吹打的时候，动作一定要轻，因为感受态细胞是很脆弱，操作基本上都要在冰上
7. 加入等体积的预冷的30%的灭菌甘油水溶液，混匀后按100 μL/管（已预冷1.5ml的EP 管）在冰上分装，-80度保存备用。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理【化学魔法，感受态细胞的秘密】哎哟喂，朋友们，咱们今天要聊的可是个高大上的科学话题——氯化钙法制备感受态细胞的原理。
这个听起来是不是有点像变魔术？没错，它就像是把普通的水变成了神奇的药水，让我们能够在实验室里轻松地培养出那种超级无敌的感受态细胞！咱们得知道什么是感受态细胞。
简单来说，就是那些经过特殊处理，能够接受外源DNA并稳定表达的细胞。
这些细胞就像是一个待命的“小精灵”，一旦有新的“任务”下达，它们就能立刻变身为执行者。
而氯化钙法，就是我们用来驯服这些小精灵的神奇魔法棒。
那么，氯化钙法是怎么做到的呢？其实，这全赖于氯化钙那神奇的“魔力”。
想象一下，你手里握着一根魔杖，轻轻一挥，那些原本呆若木鸡的细胞们就变得活跃起来，仿佛被施了魔法一样。
这个过程就像是在给细胞们穿上了一件隐形的斗篷，让他们能够在各种环境中自由穿梭，不受外界干扰。
接下来，咱们来聊聊氯化钙法的具体操作步骤。
你得准备好一些氯化钙溶液和感受态细胞。
然后，按照一定的比例将氯化钙溶液加入到感受态细胞的培养基中。
这时候，你只需要静静地等待，看着那些细胞们如何在氯化钙的“魔法”下翩翩起舞。
大约过了几分钟后，你就会发现，那些原本僵硬的细胞们已经变得活力四射，仿佛被注入了一股新生的力量。
当然啦，氯化钙法虽然神奇，但也不是万能的。
有时候，我们可能需要根据具体情况对氯化钙法进行调整。
比如，如果你需要培养的是一些对氯化钙敏感的细胞，那么你就得小心一些，避免过度使用氯化钙。
也要注意观察细胞的变化情况，以便及时调整实验条件。
我想说的是，氯化钙法制备感受态细胞的原理就像是一场精彩的魔术表演。
它不仅让我们能够在实验室里轻松地培养出感受态细胞，还让我们对生物学领域有了更深的了解和认识。
所以，下次当你看到有人用氯化钙法制备感受态细胞时，不妨学着用一颗好奇的心去探索这个神奇的世界吧！。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
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一、我制氯化钙法感受态的步骤：
二、1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm过夜培养；
三、2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃ 200 rpm培养2.5 h
（OD600nm介于0.4-0.5）；
四、3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机
在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；
五、4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰
浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；
六、5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分
装，滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。
七、
八、需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，
然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。
九、另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。
十、
十一、热激法转化大肠杆菌
十二、1) 将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；
十三、2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；
十四、3) 加入895 μl（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的） LB液体培养基，37 ℃水浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm内，太快了容易让质粒丢失）；
十五、4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；
十六、6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（~200 μl）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；
十七、7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。
十八、
十九、二、制电击感受态的步骤（摘自cDNA文库组标准流程，大肠杆菌我很少用电转，主要是连接产物懒得纯化）：
二十、
二十一、 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）
二十二、 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。
二十三、 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
二十四、 4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
二十五、 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。
二十六、 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
二十七、7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
二十八、8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。
同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
二十九、9. 次日观察转化子生长情况，并记录。
感受态成功的关键在于：
1，试剂要冷，一直在冰上操作
2，吹细胞动作要轻柔
3，菌活力要足，一定要选对数期的菌进行
4，每次转化完成后用质粒验证
BL21是表达菌，直接转入质粒，灵敏度应该很高的。